遗传学各种技术总结

1、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP技术）
CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)技术又称为限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术。

是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性。

CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。

但在多倍体植物中的应用有一定的局限性。

另外，CAPs标记需使用内切酶，这又增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。

原理：PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。

不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。

此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。

基本流程：根据基因名称查询序列，设计引物；提取基因组DNA；PCR扩增；产物酶切，凝胶电泳。

2、TGF-β超家族
转化生长因子β(transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成，其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子( GDF)等。

TGF-β除了影响细胞的增殖、分化，还在胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面起着重要作用。

TGF-β家族成员广泛存在于从果蝇到人多种生物的各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着显著作用。

TGF-β超基因家族成员共同的特征:
(1) N - 端有1段信号肽序列, 可借以跨过内质网;
(2) 紧挨着生物活性区有由4个氨基酸(RSRR) 组成的蛋白酶加工位点;
(3) C - 末端包含9个保守的半胱氨酸的生物活性区, 靠分子间的二硫键形成二聚体。

3、聚合酶链式反应-单链构象多态（PCR-SSCP技术）
日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。

作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析。

在随后的研究中，作者又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。

其基本过程是:
①PCR扩增靶DNA;
②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;
③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;
④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。

若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。

4、单核苷酸多态性（SNP）
指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。

在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。

包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失
SNP在基因组内的形式:
①遍布于基因组的大量单碱基变异;
②分布在基因编码区(coding region) , 称其为cSNP，属功能性突变。

特点:密度高、富有代表性、遗传稳定性、易实现分析的自动化。

5、全基因组关联分析（GWAS）
是应用基因组中数以百万计的单核苷酸多态性（SNP）为分子遗传标记，进行全基因组的水平上的对照分析和相关性分析，通过比较发现影响复杂形状的基因变异的新策略。

目前GW AS研究主要采用两阶段或多阶段研究：
第一阶段：用覆盖全基因组范围的SNP进行病例对照分析，统计分析后筛选出较少数量的阳性SNP进行第二阶段或随后的多阶段中采用更大样本的病例对照样本群进行基因分型，然后结合两阶段或多阶段的结果进行分析。

这种设计需要保证第一阶段筛选与疾病相关的SNP的敏感性和特异性，尽量减少分析的假阳性与假阴性的发生，
第二阶段：应用大量样本人群，甚至在多种人群中进行基因分型验证。

6、基因芯片技术
基因芯片又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）。

其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。

基因芯片能够同时平行分析数万个基因,进行高通量筛选与检测分析,解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。

根据所用探针类型,基因芯片可分为cDNA ( comp lement DNA)芯片和寡核苷酸芯片;根据检测目的又可分为表达谱芯片和单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms, SNP)芯片。

7、卫星DNA标记
是一种新型的分子遗传标记，具有数量大、分布广且均匀、多态信息含量高、检测快速方便等特点，已经被广泛应用于动、植物基因定位、连锁分析、血缘关系鉴定、遗传多样性评估、系统发生树构建、标记辅助选择等方面。

特点：多态性和保守性，高灵敏性和高度特异性
微卫星DNA标记原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，由于核心序列串联重复数目不同，则通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，
根据扩增分离片段的大小决定基因型，并计算等位基因频率。

保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。

微卫星侧翼序列在相近的物种中具有一定的保守性。

因此，某一物种的微卫星引物可以在其相近的物种中得以使用，这就使微卫星位点的检测丁作大幅度减少，从而加快对不同物种间比较基因图谱的制作速度。

为此，常利用微卫星标记来检测个体基因型，统计群体中等位基因的数目和频率，结合分子遗传学和数量分类学原理，计算各个品种的遗传变异程度、生存稳定性，从而初步评估品种的遗传多样性及品种间的亲缘关系与分化关系。

8、高通量测序技术（NGS技术）
又称下一代测序，是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。

目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina 公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。

原理：酶级联化学发光反应
①PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。

②在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。

③焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，A TP 就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光，CCD 检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

单分子测序技术
基于全内反射显微镜(total Internal reflection microscopy, TIRM) 的测序技术原理：
①待测DNA样品随机打断成小片段，在每个小片段的末端加上poly-dA；
②小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT 引物进行杂交并精确定位，并逐一加入荧光标记的末端终止子；
③涤、成像，切开荧光染料和抑制基团；
④涤、加帽，允许下一个核苷酸的掺入；
⑤样通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。

9. 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。

一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。

一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。

当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区
域这一段连续的碱基对发生解链。

当浓度度再升高依次达到其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。

直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。