变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告

变性梯度凝胶电泳DGGE
刘琳 1131428 环境科学
一、 实验目的
1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。

2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。

3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。

二、 实验原理
双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。

不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。

同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。

然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA
分子，此时它们又能在胶中继续迁移。

因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：
变性剂
Low
High
在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。

当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。

DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。

垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。

本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。

三、 实验器材与药剂
器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪
试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料 变性剂Low high
四、实验步骤
1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。

其中35%的变性溶液需要加入6ml 90%的变性胶溶液和9.5ml的0%的变性胶溶液；55%的变性溶液需要加入9.5ml 90%的变性胶溶液和6ml的0%的变性胶溶液。

2．将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。

将三根聚乙烯细管中短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml 的注射器上。

在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件；
反时针方向旋转凸轮到起始位置。

将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置（15.5）。

配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中，每管加入12 μl TEMED，80 μl 10% APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。

将两种变性溶液分别吸入相应注射器中。

通过推动注射器推动杆小心赶走气泡；分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连，轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中，灌完后插上梳子，迅速清洗用完的设备。

3．待胶干后，在梳孔中加入相应样品，之后在75V的条件下电泳20h。

4．在200ml 1×TAE中加入30ul sDNA 染料 (或20ul 1%EB ），混匀后小心倒入一容器中；
拨开一块玻璃板，将胶（带着一块玻璃板）放入容器中；轻轻晃动玻璃板，使胶与玻璃板脱落，置水平摇床轻轻摇晃染色20min。

5．利用生物电泳分析系统对染色后的胶进行拍照。

五、实验结果记录并整理
如图所示，在紫外透射仪的观察下，可明显发现跑出很多条条带。

上面和底部几乎没有明显条带出现，条带显示居中下，说明变性胶的浓度范围可以适当缩小。

这样可以更好地分离中间较为集中的条带。

在同一水平方向上，有些条带亮度呈依次增强的趋势，这表明该微生物在水净化处理系统中依次增加；条带亮度不变的表明，该微生物的数量并没有变化；条带亮度依次减弱，表明该微生物已经不适应系统中的环境，数量在逐渐减少。

在胶的下半部分，条带之间的间隔比较小，有些辨别不清楚，这可能与电压较小且电泳时间过长有关。

左边的纯菌种跑出了四条条带，表明有些纯菌种可以跑出多条条带的。

右边也是纯菌种，理论上应该只有一条条带，但结果有很多条，可能是实验操作时出现了污染。

六、思考
1．实验过程中需要注意些什么细节？
1)配制试剂时一定要用去离子水
2)在混合和灌胶时应避免产生气泡。

3)制胶是关键。

玻璃板一定要洗干净，在灌胶时，要匀速的转动滑轮，将凝胶液匀速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。

4)灌完胶后要立即清洗注射器，以防胶凝固，堵塞管子.
5)点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样
6)每次用完仪器后要及时清理，玻璃板一定要清洗干净，放置妥当。

2．通过这个实验你有什么收获？这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助？
变性梯度凝胶电泳（DGGE）让我了解到现在微生物群落的研究方法的先进性，在分子生物学的研究中具有重要的意义。

变性梯度凝胶电泳可以区分不同群落中微生物的种类。

而且，此次实验对今后的毕业论文课题开展奠定了良好的基础。

3．如果你在做DGGE实验时得到的指纹图谱的所有条带都在凝胶的上端，可能是什么因素导致的，你怎么来解决这个问题？实验前做什么样的准备工作可以避免这样的结果出现？
可能导致的原因有：
①变性剂浓度过大，双链DNA开始电泳后立即部分裂解为单链后，始终保持较小的电泳速度，因而导致结果偏上。

②电泳时电压过低，导致电泳速度影响条带位置。

③电泳时间太短。

④GC浓度不理想。

解决措施
①适当降低变性剂的浓度
②增加加电泳电压
③加长电泳时间
4.如果你的DGGE图谱很模糊，只有很少的几个条带，这个结果能用吗？可能是什么原因导致的？
不能用。

可能是由于变性胶浓度不合适而导致产物结果无法完全呈现在图谱上。

除此外，也可能是因为样品量过低而导致图谱模糊。

在实验过程中中，操作过程、胶的均匀程度、玻璃板的洁净程度等都会影响电泳的结果。