流式细胞术实验方法及应用
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术的操作、原理与应用
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
1
5
50
104
1.7 min
20 s
2s
105
16.8 min 3.4 min
20 s
106
2.8 h
3.4 min
3.4 min
107
1.2 天
5.6 h
34 min
分选时间表(机器流速10000个/s时)
分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。
分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达 99%以上。
光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3,
FL4)。
PMT
前向散射光 光电二极管
（二）电信号两种放大方式
由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分 析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin) log)
电子系统
光电转换器 数据处理系统
细胞分选系统
喷嘴 电偏转板 样本收集器
1.3.1 液流系统
鞘流技术：根据层流原理 发展起来的技术，可以实 现两种液体的同轴流动， 样本细胞流位于轴心稳定 流动，外面包裹有鞘液 (sheath)。
流体动力学聚焦：稳定的 液流从截面积较大的部分 流入截面积较小的部分后， 有一个聚焦收缩作用，细 胞流直径被约束在1020um，避免了多个细胞重 叠进入检测区。
流式细胞实验原理及应用
流式细胞实验原理及应用首先，样品准备是流式细胞实验的关键步骤之一、细胞需处于悬浮液中才能通过流式细胞仪。
样品准备包括细胞分离、洗涤和调整浓度等步骤。
通常，细胞样品从组织或培养物中分离，离心沉淀后经过洗涤去除细胞培养液中的残留物，最后将细胞悬浮于缓冲液中。
其次，细胞标记是流式细胞实验的核心步骤之一、在流式细胞实验中，细胞表面或内部的特定分子可以通过适当的标记物进行标记，以便在流式细胞仪中进行检测。
常用的细胞标记方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和利用特定的抗体与细胞表面受体结合等。
通过流式细胞实验，我们可以通过标记特定分子表达来研究细胞的功能、状态和变化。
最后，细胞检测是流式细胞实验的最后一步。
通过流式细胞仪，可以对标记的细胞进行检测和分析。
流式细胞仪通过激光束照射样品中的细胞，测量细胞发射的荧光信号和散射光等物理性质，从而获得与细胞特性有关的数据。
这些数据可以用于定量和定性分析，例如分析细胞表面标记物的表达水平、颗粒物的大小和形状等。
流式细胞实验在生命科学研究中有着广泛的应用。
它可以用于研究细胞的免疫表型，例如探究免疫细胞亚型的分布和功能状态。
同时，流式细胞实验还可用于分析细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和细胞分化等生理过程。
此外，流式细胞实验还可应用于肿瘤学研究和临床诊断，如肿瘤细胞表面标记物的检测和癌症患者的免疫监测等。
总之，流式细胞实验是一种快速、准确的细胞检测和分析技术。
它通过针对特定分子的标记和仪器的测量，实现对单个细胞的定量和定性分析。
由于其高通量、高灵敏度和高特异性的特点，流式细胞实验被广泛应用于细胞学、免疫学、遗传学等领域，并为相关研究提供了有力的工具和方法。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞仪实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除流式细胞仪实验报告篇一：流式细胞术实验报告流式细胞术实验目的掌握流式细胞仪的工作原理掌握用流式细胞仪测量细胞群体DnA含量分布的方法了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用实验原理流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、Dn(:流式细胞仪实验报告)A、RnA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DnA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如g0/g1期的DnA含量为2c，而g2期的DnA含量是4c。
利用pI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DnA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器、材料与试剂仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、eppendorf管。
试剂：70％乙醇（保存于4℃），Rnase（-20℃保存），pI染液（避光保存于-20℃），pbs(ph7.4，保存于4℃)实验步骤样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。
2000rpm15min收集固定细胞，pbs洗2次。
用100μLpbs重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
加pI染液50μL和Rnase约2μL室温放置15min。
上机检测。
样品测定并使用modFitLT软件分析结果。
实验结果与讨论:所测样品中各周期时相的百分比：g1期68.48%g2/m期16.63%s期14.89%g2：g1=1:1.77cV12.16提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。
流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DnA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（Fcm综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞术的基本原理及其应用
流式细胞术的基本原理及其应用流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记物进行定量和定性分析。
流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分析软件等。
应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有广泛的应用。
以下是几个流式细胞术的应用举例：1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。
这种技术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫疾病的诊断。
2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。
通过分析细胞周期，可以确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发展过程中的细胞生长和增殖。
3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋亡（程序性细胞死亡）的过程。
凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。
通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。
4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。
这种细胞分选技术在基因表达、单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。
5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。
例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。
总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。
流式细胞术实验报告
流式细胞术实验报告流式细胞术实验报告引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它通过测量细胞在流动过程中的荧光信号，可以快速、准确地分析细胞的数量、大小、形态和功能等特征。
本实验旨在利用流式细胞术对细胞进行表型分析，并研究不同条件下细胞的变化。
材料与方法1. 细胞样本准备：从培养皿中取出细胞，用PBS洗涤，离心沉淀后，再用PBS 悬浮细胞，使其浓度达到所需的范围。
2. 细胞染色：将细胞悬浮液分装于离心管中，加入适量的荧光标记染料，轻轻摇匀，避免产生气泡。
3. 流式细胞术仪器设置：根据实验需要，调整流式细胞术仪器的参数，如激光功率、荧光信号检测通道等。
4. 样本检测：将细胞悬浮液注入流式细胞术仪器，开始检测。
记录细胞的散射信号和荧光信号，并设置相应的控制样本。
5. 数据分析：利用流式细胞术软件对获得的数据进行分析，包括细胞数量、比例、荧光强度等参数。
结果与讨论通过流式细胞术实验，我们成功地对细胞进行了表型分析，并观察到不同条件下细胞的变化。
以下是我们的结果和讨论。
1. 细胞数量和比例的变化我们首先对细胞数量和比例进行了分析。
结果显示，在不同处理条件下，细胞数量和比例存在显著差异。
例如，在处理A条件下，细胞数量明显增加，而在处理B条件下，细胞数量有所下降。
这表明不同条件对细胞生长和增殖有不同的影响。
2. 细胞大小和形态的变化我们进一步分析了细胞的大小和形态的变化。
通过测量细胞的散射信号，我们可以得到细胞的大小和形态信息。
结果显示，在处理A条件下，细胞的大小明显增加，形态变得更加圆润。
而在处理B条件下，细胞的大小和形态相对稳定。
这可能与处理A条件下的细胞分化和增殖有关。
3. 荧光信号的变化我们还对细胞中特定蛋白的表达进行了分析。
通过标记特定蛋白的荧光染料，我们可以测量细胞的荧光信号强度。
结果显示，在处理A条件下，特定蛋白的表达明显上调，而在处理B条件下，特定蛋白的表达下调。
细胞生物学技术：7流式细胞术---原理、操作及应用
（三）散射光的作用
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的 细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
BD公司分析型流式细胞仪
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
流式细胞术基本原理与应用实验报告
流式细胞术基本原理与应用实验报告一、引言细胞是生命的基本单位，对于细胞的研究是生命科学的重要组成部分。
流式细胞术是一种高效、快速、准确的细胞分析技术，可以对单个细胞进行分析和排序，广泛应用于生命科学、医学、生物工程等领域。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和应用实验。
二、流式细胞术基本原理流式细胞术是一种基于细胞荧光标记的技术，其基本原理是将细胞悬浮液通过细胞分离器，使细胞单个通过激光束，激光束照射到细胞上，激发荧光标记物，荧光信号被收集并转化为电信号，通过计算机进行分析和排序。
流式细胞术的主要组成部分包括细胞分离器、激光器、荧光探测器和计算机。
细胞分离器通过压力和速度的调节，使细胞单个通过激光束。
激光器产生激光束，激光束照射到细胞上，激发荧光标记物。
荧光探测器收集荧光信号，并将其转化为电信号。
计算机对电信号进行分析和排序，得到细胞的荧光信号和数量信息。
三、流式细胞术应用实验1.细胞表面标记物检测细胞表面标记物是细胞表面的蛋白质、糖类等分子，可以用于细胞的鉴定和分类。
流式细胞术可以通过荧光标记物检测细胞表面标记物，从而对细胞进行分类和分析。
实验步骤：（1）制备细胞悬浮液。
（2）加入荧光标记物，使细胞表面标记物与荧光标记物结合。
（3）将细胞悬浮液通过流式细胞术仪器，收集荧光信号。
（4）通过计算机对荧光信号进行分析和排序，得到细胞表面标记物的信息。
2.细胞周期分析细胞周期是细胞从一个细胞分裂到下一个细胞分裂的过程，包括G1期、S期、G2期和M期。
流式细胞术可以通过荧光标记物检测细胞DNA含量，从而对细胞周期进行分析。
实验步骤：（1）制备细胞悬浮液。
（2）加入荧光标记物，使细胞DNA与荧光标记物结合。
（3）将细胞悬浮液通过流式细胞术仪器，收集荧光信号。
（4）通过计算机对荧光信号进行分析和排序，得到细胞DNA含量的信息。
3.细胞凋亡检测细胞凋亡是细胞自我死亡的过程，是细胞生命周期的重要组成部分。
流式细胞术可以通过荧光标记物检测细胞凋亡，从而对细胞生命周期进行分析。
流式细胞术基本原理与应用实验报告
流式细胞术基本原理与应用实验报告流式细胞术（Flow Cytometry）是现代细胞学研究的常用技术之一。
它以单个细胞为单位，通过光学探测技术，可以对大量不同的细胞表型进行识别、分类、计数、排序、细胞分析和分离等操作。
本次实验旨在研究流式细胞术基本原理、仪器结构与实验操作及其在生物学和医学中的应用。
一、流式细胞术基本原理流式细胞术是一种利用流式细胞仪和荧光染料或抗体等标记技术，快速、高效地鉴定、分类、计数和分离单个细胞的技术。
其基本原理是利用液体样品在流式细胞仪中快速流动，在荧光灯激发下，荧光成像技术将单个细胞的荧光信号检测、分析、处理并转化为数字信号，通过计算机软件进行图像分析和数据处理。
流式细胞术具有以下优点：1.高速：流式细胞术可以快速实现对数百个样品的扫描和分析。
2.高效：流式细胞术可以实现对纯化和分离指定细胞群的快速处理。
3.灵敏度高：流式细胞术可以检测微量的荧光信号和蛋白分子。
4.精度高：流式细胞术可以消除漂移和污染等影响因素，准确地测定样品中的细胞表型。
二、仪器结构与实验操作流式细胞仪由样品进样器、激光器、荧光探测器、FSC/SSC探测器、计算机控制器和数据分析软件等组成。
其基本操作步骤为：将样品置于进样器中，通过样品速度调节阀门调整样品流速，激活荧光标记，由荧光物质发射激光激发荧光，再由光学系统光学镜片收集所发出的荧光光子，并将其转换为电子信号，通过数据分析软件将处理过的信号转换为图像和数据。
三、应用实验及其意义流式细胞术广泛应用于生命科学和医学领域，尤其在免疫学、细胞生物学、肿瘤学及感染病原体学等领域有着重要的应用价值。
例如，流式细胞术可以用于：1.研究细胞群体：通过流式细胞术可以研究特定细胞群体，了解其特征、性质和分布等信息。
2.检测表型：流式细胞术可以检测特定细胞表型，包括表面标记、抗原和细胞周期等特征。
3.筛选细胞亚群：利用流式细胞术分选技术，可以从样本中快速筛选出目标细胞亚群，为研究和治疗提供便利。
流式细胞术基本原理与应用实验报告
流式细胞术基本原理与应用实验报告一、引言流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物学、医学和临床诊断领域的高通量技术。
它可以快速地分析细胞群体的形态、数量、大小、表面分子表达和内部结构等信息，从而为科学家们提供了许多有价值的数据和见解。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和应用实验，以期为读者提供更深入的了解。
二、流式细胞术基本原理1. 光学系统流式细胞仪主要由光源、透镜系统、光谱仪和检测器等组成。
光源可以是氩离子激光器或其他激光器，它们会发射出不同波长的激光束。
透镜系统会对激光束进行聚焦和扩散，使其能够穿过样品中的单个细胞。
光谱仪则会将激光束分成不同波长的色带，并通过探测器来检测样品中各个荧光染料或标记物的信号。
2. 样品处理在进行流式细胞术之前，需要对样品进行处理。
一般来说，样品需要进行单细胞悬浮处理，以便于在流式细胞仪中进行分析。
这个过程可以通过机械分离、酶消化或超声波破碎等方法实现。
3. 荧光标记为了使细胞的某些结构或分子能够被检测到，需要将它们标记上荧光染料或其他标记物。
这些标记物可以是抗体、蛋白质、DNA探针等。
当激光束照射到样品中时，荧光染料会发出特定波长的荧光信号，从而被检测器捕捉到。
4. 数据分析流式细胞术所得到的数据通常是一个多维度的数据集合，其中包括了每个单个细胞的大小、形态、荧光强度等信息。
为了对这些数据进行更深入的分析和解释，需要使用专业软件进行数据处理和可视化。
三、应用实验1. 细胞表面抗原检测流式细胞术可以用于检测细胞表面的抗原表达情况。
通过将适当的荧光标记物与抗体结合起来，可以快速地对细胞表面的抗原进行定量和定性分析。
这种方法在肿瘤学、免疫学和感染病学等领域中得到了广泛应用。
2. 细胞周期分析流式细胞术也可以用于细胞周期分析。
通过将DNA染料与样品中的单个细胞结合，可以对不同阶段的细胞进行分类和计数。
这种方法可以用于评估细胞增殖速率、治疗药物的效果等方面。
流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
流式细胞术的基本原理与应用
流式细胞术的基本原理与应用1. 流式细胞术简介流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，顾名思义，它是通过流式细胞仪对细胞进行快速高效的分析和计数的一种方法。
流式细胞仪结合了光学、电子学和生物学的原理，在细胞的分析和生物标记方面发挥着重要的作用。
2. 流式细胞术的基本原理流式细胞仪通过采用一系列光学镜头和激光发射器来激发和检测细胞中的荧光标记物。
其基本原理如下：•细胞的准备：首先需要制备待测样本的单细胞悬液，并加入荧光标记物以特异性地标记感兴趣的细胞组分。
荧光标记物可以是通过特异荧光染料直接染色的，也可以是通过激活荧光分子标记的。
•光学系统：流式细胞仪内部包含多个光学系统，它们可以激发和检测荧光标记物。
通常，一台流式细胞仪至少搭载有一个激光器和多个检测器。
激光器发射的光束通过光学镜头聚焦到待测细胞上，激发细胞内的荧光标记物。
荧光标记物发出的荧光信号经过滤光片分离并收集到相应的检测器中。
•数据采集和分析：流式细胞仪通过控制细胞的流速和激发光的强度来获取细胞的相关数据。
检测到的荧光信号被转换成电信号并通过放大器进一步增强。
数据最后通过计算机进行采集和分析。
根据荧光信号的强度和特征，可以获取到细胞的表型信息、功能信息以及分子相互作用等数据。
3. 流式细胞术的应用流式细胞术广泛应用于生物医学和生命科学领域，以下是几个常见应用领域的示例：3.1 免疫学研究•细胞表型分析：流式细胞术可以检测和鉴定细胞表面和胞内的各种免疫相关分子，如免疫球蛋白、细胞表面受体、细胞凋亡标记物等，以帮助研究细胞免疫表型的变化。
•细胞亚群分析：流式细胞术可以通过多种荧光标记将细胞群体分成不同的亚群，以研究免疫细胞在某些特定疾病或独特生理状态下的数量和功能变化。
3.2 癌症研究•肿瘤细胞鉴定：流式细胞术可以帮助鉴定和分离肿瘤细胞，从而研究其特性和功能。
例如，可以通过检测特定肿瘤标记物，鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）。
流式细胞术原理及应用
流式细胞仪电子系统
如何将光信号显示于电脑上进行显示分析？
➢ 将模拟信号转化为数字信号 ➢ 计算每个脉冲峰的高度、宽度和面积 ➢ 和计算机连接以传出数据
荧光信号
光电倍增管PMT 电信号 放大器
线性放大：输入与输出线性关系 如DNA、RNA、总蛋白
对数放大：输入与输出对数关系 如细胞膜表面抗原
流式分选系统
Annexin-V FITC单染管 样本
Annexin-V/PI检测细胞凋亡实验结果分析
圈定准确的细胞群
Q1（Annexin-VFITC- PI+）：裸核 Q2（Annexin-VFITC+ PI+）：晚期凋亡细胞或死细胞 Q3（Annexin-VFITC- PI-）：活细胞 Q4（Annexin-VFITC+ PI-）：早期凋亡细胞
• 激发的光谱必须在仪器滤光片能 接受的合适范围内
• 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 • 染料的亮度与抗原表达量相匹配
即根据抗原表达强弱合理选择荧 光抗体：低表达用强荧光，强表 达可以用弱荧光 • 根据仪器型号选择抗体，不同的 仪器滤光片设置不同，对荧光素 相对检测灵敏度也不同
染色
Hale Waihona Puke 对照设置对照设置阴性对照：排除自发荧光 同型对照：排除非特异性荧光 补偿对照：调节补偿
同型对照抗体与实验所用的特异性抗体 a.相同种属来源 b.相同免疫球蛋白及亚型 c.相同荧光素标记 d.由未免疫动物血清纯化而来
例如一个双色染色的实验 使用的抗体为抗体CD3 FITC，抗体CD4 PE对应的同型对照是IgG1 FITC，IgG1 PE
细胞凋亡检测
1 （Annexin-v/PI、线粒体膜电位、Caspase-3、TUNEL） 2 细胞周期检测
流式细胞术实验方法及应用
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。
4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
七、荧光补偿
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤
离心 1000r/min，5min PBS 洗2次
单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 100目钢筛网轻搓 生理盐水
收集滤液
300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min
PBS 洗2次 单细胞悬液。
研磨法
组织块洗去血液 研磨器研至匀浆 100目钢筛网
300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS洗2次
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长 常用荧光素
异硫氰酸（FITC）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI）
藻红蛋白偶联物（PECY5）
藻红蛋白偶联物（PECY7）
别藻青蛋白（APC）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
激发光波长（nm ）
488 488 488 488
488
633 633
物的特异性。 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂
和固定剂等影响。
常用荧光探针组合
细胞表型分析： 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5 四色分析：三色分析+ECD
流式细胞术实验报告
流式细胞术实验报告实验报告：流式细胞术一、实验目的本实验的目的是通过流式细胞术技术进行细胞的分析和定量的测定，研究细胞的物理与化学性质，同时对其进行分类鉴定。
二、实验原理流式细胞术是利用细胞本身特有的荧光素和荧光物质来进行细胞分析的一种方法，其基本原理是将待检测的细胞样品通过加荧光素和荧光物质，使细胞样品产生荧光信号，并利用激光束扫描进行荧光信号的测定，根据信号的强度和时间对细胞进行分类和测定。
三、实验步骤1.准备样品：取细胞样品进行悬液处理，去除其中的杂质。
2. 加荧光素和荧光物质：在样品中加入荧光素和荧光物质，使细胞样品产生荧光信号。
3. 流式细胞术仪：将样品注入流式细胞术仪，并通过激光束扫描进行荧光信号的测定。
4. 分析结果：根据测定结果进行数据处理，对细胞进行分类鉴定。
四、实验结果通过测定发现，本实验的细胞样品产生了明显的荧光信号，通过激光束扫描进行测定，得出了一组详细的细胞数据结果。
根据测定结果，我们可以对样品进行分类鉴定，得出了准确的实验数据结果。
五、实验结论通过本实验的结果分析，流式细胞术技术可以对细胞样品进行高效、准确的分析和测定，具有重要的科学研究意义和应用前景。
六、实验注意事项1. 在实验室操作时要注意安全，佩戴好相应的防护用具，避免意外伤害的发生。
2. 在加荧光素和荧光物质时，要掌握好药品和样品的使用量，避免荧光信号出现过度强度，否则会影响实验的结果。
3. 流式细胞术仪的操作需要掌握好相应的操作技能和流程，避免操作失误或损坏仪器设备。
四、实验器材和试剂1.细胞样品，可以是细胞悬液或组织细胞。
2. 荧光素和荧光物质，可以根据需要选择相应的荧光剂。
3. 流式细胞术仪，包括激光束扫描仪和电脑数据处理系统等。
5.实验操作时间本实验的操作时间大概需要2-3小时左右，其中包括样品准备、荧光素添加和细胞测量等步骤。
6.参考文献1.罗一驹, 刘思成, 陈艳妮. 流式细胞术[J]. 临床检验杂志, 2018,36(1):159-161.2.王婷婷, 王斌, 陈永瑞. 流式细胞术在癌症检测中的应用研究进展[J]. 华西药学杂志, 2018, 33(7):703-706.3.刘志俊, 吴德福, 于炜. 流式细胞术在肿瘤治疗中的应用研究[J]. 中国实用医学, 2018, 13(8):201-202.。
流式细胞术多色荧光分析指南
流式细胞术多色荧光分析指南流式细胞术多色荧光分析是一种用于细胞表型、功能和状态分析的重要方法。
利用流式细胞仪和多色荧光标记的抗体，可以同时检测多个细胞表面分子、胞内蛋白、核酸等分子的表达水平和活性状态，为研究细胞的功能和疾病发生机制提供了强大的技术支持。
本文将详细介绍流式细胞术多色荧光分析的实验步骤、注意事项和数据分析方法。
一、实验步骤1.细胞样品的制备首先，需要准备良好生长状态的细胞样品。
细胞可以来自体外培养的细胞系、原代细胞、细胞悬液、血液或组织样本等。
将细胞样品离心收集，并用适当的生理盐水或细胞培养基洗涤细胞，去除杂质和细胞培养基中的药物或抗体。
2.细胞荧光标记在合适的体积中加入细胞样品，使细胞浓度适宜（一般为10^6 ~10^7个/ml）。
接下来，根据研究需求，在细胞样品中加入适当浓度的荧光标记抗体，进行免疫反应。
免疫反应一般需要在室温下进行20 ~ 30分钟。
为了防止非特异性结合，可以添加适当浓度的不相干（Isotype）控制抗体。
3.洗涤和固定免疫反应结束后，需要用生理盐水或缓冲液进行洗涤，去除未结合抗体。
洗涤时可以采用离心沉淀法或流式细胞术仪器自带的洗涤功能。
洗涤后，用合适的细胞固定液对细胞进行固定。
常见的细胞固定液有甲醛、乙醛、琼脂糖等，可以依据实验设计选择适当的固定液。
4.流式细胞仪检测固定后的细胞样品可以在流式细胞仪上进行数据采集和分析。
在操作流式细胞仪之前，需要对仪器进行标定，确保仪器的精度和准确性。
将固定细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，设置适当的流速和相关参数。
流式细胞仪会激发标记物的荧光信号，并检测细胞产生的荧光信号。
根据标记物的不同荧光波长，可以设置相应的滤光片和探测器。
二、注意事项1.细胞保存和操作温度细胞样品的保存温度和操作温度对实验结果具有影响。
一般细胞样品需要在4℃冷藏保存，防止细胞的失活和变性。
在实验过程中，保持适宜的操作温度（一般为室温）是重要的，避免细胞过热或过冷。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于 <600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um 颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。
流式细胞术的应用范围
细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡
其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度
加OptiLyes C溶血素250ul
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体
CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照
淋巴细胞亚群检测临床意义：
育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次
→上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记
速度快 极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万 个
细胞，甚至几万个细胞。 多参数分析 可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细 胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把 细胞群分为各亚群。
定性、定量分析细胞 通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、 抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高
参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大， 散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反 映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该 道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.
流式细胞分析中常需要两种或两种以上不 同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由 于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性 质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误 差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补 偿。
八、数据分析
流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行 分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独 特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一 片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数 分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形 门、任意门和四象门等。
细胞表型分析：
双色分析：FITC与PE
三色分析：双色分析+PE-CY5
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)
方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º C ，24h
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
100目钢筛网过滤 300目尼龙 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
三、单克隆抗体标记荧光探针选择
1.了解激发光波长和发射波长
激发光波长（nm ）
异硫氰酸（FITC） 488 发射波长(nm) 525（绿）
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂：
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、
商品化固定破膜剂（A、B）。
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 100目钢筛网
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
离心
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。
300目尼龙网过滤
离心
1000r/min，5min
PBS洗2次
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
醇乙脱水： 70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ 100％醇乙 →90%→80%→70％→50％ →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇，蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃，15-30min
冰PBS 网过滤 离心 悬液
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板 胰蛋白酶 吸去培养液
小鼠 兔抗小鼠
接抗体，只能采用此方法。
直接标记是在标记时加入连接着荧光素 的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用
直
标
于各实验室。
根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内 抗
原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵
FSC
SSC
1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的 增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发 生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期 （4C）。
2C→4C
2C
4C
FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对 DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特 异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧 光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧 光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次 含血清的培养基 单细胞悬液。
吹打
PBS洗2次
3. 组织器官单细胞悬液的制备
酶消化法
组织器官 机械法 单细胞制备仪 剪碎法 网搓法 研磨法
（1）、酶消化法
组织块洗去血液
酶 滤
37℃，15-30min
剪成小块
胰蛋白
含血清的培养基
100目钢筛网过滤
离心
300目尼龙网过
单细胞悬液
胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝
素液，臵于4℃ 冰箱中静臵 6-12h
尿 液：收集24h 尿液，臵4℃冰箱中自然沉淀 2h 冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内臵
6-12h
间
标
羊抗兔
五、荧光标记 主要包括间接免疫荧光染色和直接免 疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一 抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加 入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗 体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前 很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直
流式细胞术实验方法及应用
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm）
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒， 经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细 胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。