细胞破碎-分离纯化

键连接，某些以β -1,6糖苷键连接），几丁质（以 微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层(a)是α -和 β - 葡聚糖的混合物，第 2 层 (b) 是糖蛋白的网状结 构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层(c)主要是蛋 白质，最内层 (d) 主要是几丁质，几丁质的微纤维 嵌入蛋白质结构中。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和 聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁 质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。
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细胞破碎
细胞破碎技术
非机械法破碎方法
渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents）
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细胞破碎
细胞破碎技术
高压匀浆器（High pressure homogenizer）
阀座
阀杆 撞击环 阀杆 压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
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细胞破碎
概述
破碎细菌的主要阻力
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链 上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联 程度大，则网结构就致密。
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在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，
纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素 （酚类组分的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了 细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。
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细胞破碎
细胞破碎技术
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细胞破碎
概述
初生细胞的经纬模型
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细胞破碎
概述
次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁
之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μ m以上)，常 有三层组成。
细胞破碎
概述
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细胞破碎 植物细胞初生壁的化学组成
组分
纤维素 半纤维素 果胶物质
结构和分类
β－1，4－D－葡聚糖
木葡聚糖 甘露聚糖 木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和40-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖） 半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖
概述
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 细胞破碎 碎片分离 路线一 路线一A 路线二 清液－胞外产物
溶解(加盐酸胍、脲)
复性
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥)
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蛋白质
结构蛋白 各种酶类
凝集素
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细胞破碎
概述
“经纬”模型
目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert 等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的 微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上 面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则 排列方向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构 成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白 （富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于 细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网， 径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联， 构成更复杂的网络系统。半纤维素和果胶等胶体则填 充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有 弹性。
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细胞破碎
概述
真 核 细 胞
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细胞破碎
概述
organelle细胞器
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细胞破碎
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细胞破碎
细胞破碎技术
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀 锥型阀 球型细胞破碎阀 高压匀浆器各种阀型设计
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细胞破碎
细胞破碎技术
高压匀浆法适用的范围
高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎。 料液细胞浓度可达到20%左右。 ☆团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高 压匀浆法。
细胞破碎
概述
酵母细胞壁的结构示意图
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细胞破碎
概述
破碎酵母细胞壁的阻力
酵母细胞壁的结构示意图如图 15－2所示，细 胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细 胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细 纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6 一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内 部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状 结构上，也可以不连接。 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻 力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
15.2
细胞破碎技术
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和
不同类型的细胞壁破碎。
破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
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细胞破碎
细胞破碎技术
机械法
机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）
出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和 高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式
上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可 连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温 度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中， 对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常 采用多次循环的操作方法。
细胞破碎
概述
概
述
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释 放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化 物质（产品）的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以 前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
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细胞破碎
概述
虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但是革兰氏
阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴 性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰 氏阳性菌细胞壁较厚，具有 20 ～ 80nm 的肽聚糖层，约占细 胞 壁 成 分 的 40 ～ 90 ％ ， 此 外 细 胞 壁 还 含 有 大 量 磷 壁 酸 (eichoic acid)。而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2 ～ 3nm，占细胞壁成分的 10％左右，由于肽聚糖之间仅由四肽 侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于 细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较 厚的外壁层 (约8～10nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其 它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。
细胞破碎
概述
概
述
一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细 胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药 和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位 成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌 到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行 固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即 可。其后续分离和纯化都相对简单。
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细胞破碎
概述
概
述
★但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细 胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞 分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类 rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞 破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然 后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
概述
细胞膜的结构
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细胞破碎
概述
细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）
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细胞破碎
概述
几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖 （peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链 （glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构， 包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨 酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D氨基酸与二氨基庚二酸存在。
细胞破碎
细胞破碎技术
操作原理
Manton Gaulin高压匀浆器是常用的设备，它 由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump） 和排出阀（ discharge valve ）组成，排出阀具有狭窄的小 孔，其大小可以调节。图15-5为高压匀浆器的排出阀结构简 图，细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排
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细胞破碎
概述
概
述
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细 胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原 生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞 壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此 细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质 其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强 度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的 生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变 性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条 件的优化是十分必要的。
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细胞破碎
概述 15.1.2 植物细胞壁的化学组成和结构
对于已生长结束的植物细胞壁可分为பைடு நூலகம்生壁和
次生壁两部分。
初生壁是细胞生长期形成的。 次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成
的结构。
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细胞破碎
概述
几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名称
胰岛素
宿主
大肠杆菌
用途
治疗糖尿病
人生长激素（HGH）大肠杆菌
治疗侏儒病
α--干扰素
大肠杆菌
治疗毛状细胞白 血病和卡波济肉 瘤
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生物分离工程精品课程
主讲：曹学君
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细胞破碎
概述
第十五章 细 胞 破 碎
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细胞破碎
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细胞破碎
概述
红面包霉菌(Neurospora crassa)的细胞壁 结构示意图
红面包霉菌细胞壁的结构示意图
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细胞破碎
概述
主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β -1,3糖苷