茶氨酸提取纯化工艺研究

表２絮凝后溶液中各组分含量的变化 Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ
ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ．
茶氨酸 可溶糖 蛋白质茶多酚
Ｔｈｅａｎｉｎｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＴＰ
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天然产物研究与开发
４４２
ＤＥⅦＩ ＮＡＴＵＲＡＬ ＰＲＯＤＵＣＴ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ
ｏ孙化ＮＴ
茶氨酸提取纯化工艺研究
林 智１ 杨 勇１，２ 谭俊峰１ 尹军峰１ 成 浩１ 杨贤强２＊
（１．农业部茶叶化学工程重点开放实验室中国农业科学院茶叶研究所杭州３１０００８； ２．浙江大学茶学系杭州３１００２９）
ＩＳｏＬＡＴＩｏＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ０Ｆ ＴＨＥＡＮＩＮＥ
ＬＩＮ Ｚｈｉｌ，ＹＡＮＧ Ｙｏｎ９１，２，ＴＡＮ Ｊｕｎ—ｆｅｎ９１，ＹＩＮ Ｊｕｎ—ｆｅｎ９１，ＣＨＥＮＧ Ｈａ０１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｎ．ｑｉａｎｇ’ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｔｅａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｔｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１０００８，Ｃｈｉｎａ；
取清液。测定吸附前后溶液中茶氨酸及多酚等物质
的含量，计算吸附材料的杂质吸附率及茶氨酸的保
留率。
１．４．３离子交换实验
（１）静态交换实验：在烧杯分别加入已用不同
ｐＨ值的柠檬酸缓冲液平衡过的树脂２０ ｇ及原料液 １００ ｍＬ，恒温水浴摇床中平衡２ ｈ，吸附平衡后过滤
分离树脂与清液，测定交换前后溶液中茶氨酸的含
一ｒｌ昌＼虻置一ＱｃＩｕ矗Ｑ｛Ｊ０矗。一苗扫ｉｏ口ｕ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃） 圈３不同温度对絮凝效果的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ
采用以上得到的絮凝最佳条件（包括溶液ｐＨ 值、壳聚糖质量浓度、温度等）进行操作，去除絮状沉 淀后检测清液中各组分的含量。结果表明（见表２） 絮凝对茶多酚、可溶糖的去除率不高，但对蛋白质去 除率达５０％以上，茶氨酸的回收率超过９５％。
１材料与方法
１．１原料与试剂 茶多酚工业废液由浙江东方茶业科技有限公司
提供；壳聚糖（食品级，使用时用１％ＨＡｃ配成１％的 溶液）购自澳兴生物科技公司；大孔吸附树脂、阳离 子交换树脂７３２购白安徽皖东化工厂；茶氨酸标样 购自Ｓｉｇｍａ公司；２，４二硝基氟苯（ＤＮＦＢ）购自 Ｍｅｒｃｋ公司；其余试剂均为分析纯。
（上海沪西分析仪器厂）；玻璃色谱柱（睨ｏ×
２００ｒａｍ）
１．３工艺路线
ｒ沉淀
盏魏一凝专澄清液专吸附埘柱液÷襄吞蠢］
０
◆
茶氨酸产品÷一重结晶÷一浓缩÷一洗脱过柱液
１．４试验方法
采用茶多酚工业废液作为原料，经絮凝、吸附、
阳离子树脂交换和重结晶等工艺步骤来分离纯化茶
氨酸。具体方法如下： １．４．１絮凝实验
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＴｅａ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅａｎｉｎｅ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｗａｓｔｅ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｏ ｇｅｔ ｒｉｄ ｏｆ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ，ｓｏｍｅ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃｈ— ｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ ａｓ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ，ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｉｏｎ—ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅ—ｃｒｙｓｔａｌｉｚａｔｉｏｎ
的絮凝剂观察絮凝效果。如图２如示，当溶液中壳 聚糖浓度为４～５ ｍｇ／ｍＬ时，絮凝清液Ｏ．１３６５０值 降到０．１９，并且此时茶氨酸的回收率要高于添加低 浓度的絮凝剂及离心处理。这可能是壳聚糖将大分 子物质吸附沉降时，同时使大分子物对茶氨酸等物 质的吸附减弱，从而使溶液中茶氨酸浓度提高。当 壳聚糖质量浓度小于４ ｍｇ／ｍＬ时，壳聚糖用量不
柱吸附，观察不同浓度样液和不同流速下树脂渗漏、
饱和的情况。流出液分段收集，ＨＰＬＣ法检测其茶
氨酸含量。 万方数据
１．４．４结晶
取粗茶氨酸（经阳离子交换工艺）少量配成 ８０％（ｗ／ｖ）的水溶液，添加数倍体积无水乙醇，０℃ 下冷藏２４ ｈ析晶。 １．５检测方法
茶氨酸检测：ＤＮＦＢ法ＨＰＬＣ分析检测。衍生 方法：取５０ ｐＬ待测液加入５０肛Ｌ ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ— ｃ０３、５０ ｔＬＬ １％ＤＮＦＢ，混匀后６０℃避光保温１ ｈ，加 入１００ ｇＬ ０．０１Ｍ ＫＨ２１Ｐ０４终止反应。ＨＰＬＣ分析 色谱条件：Ｗａｔｅｒｓ液相色谱仪；ＫＦ—ＡＡ ５址（２００×
茶氨酸是茶树的特有成分之一，是茶叶的特征 氨基酸，含量为干茶重量的１％～３％。近年来的研 究发现，茶氨酸具有抑制咖啡碱引起的兴奋、舒缓神 经、降血压和增强免疫力等多种保健及药用功能，开 发应用前景广阔ｕ＿４Ｊ。目前通过酶法合成生产的 茶氨酸，价格昂贵；用化学合成生产的茶氨酸的安全 性还有待验证。从茶叶中直接提取茶氨酸由于它来 源于天然产物，有着较好的安全性。调查发现，茶多 酚生产企业的工业废液中含有约２％左右的茶氨 酸，因此如能利用茶多酚工业废液为原料提取纯化
足，一部分颗粒处于无絮微粒状态，而不能很好地絮 凝，总体絮凝效果较差。当壳聚糖质量浓度大于５ ｍｇ／ｍＬ时，絮凝效果无继续明显改善。综合考虑絮 凝效果与絮凝成本，添加壳聚糖絮凝剂至质量浓度 为４ ｍｇ／ｍＬ为佳。 ２．１．３温度对絮凝效果的影响
调节茶多酚工业废液的ｐＨ值为３．０，添加壳聚 糖絮凝剂至质量浓度为４ ｍｇ／ｍＬ，考察不同温度条 件下对絮凝效果的影响。结果如图３所示，当溶液 温度在２５℃左右时，絮凝清液Ｏ．Ｄ６５０值为０．１８， 在５０℃时，曲线出现一个拐点，温度继续升高则絮 凝效果迅速变差。温度对絮凝清液中茶氨酸含量影 响不大。温度过低时，絮凝剂水解反应变慢，水解时 间延长，也可能影响絮凝效果。最佳的絮凝温度应 在２５～３５℃。
２结果与分析
２．１ 絮凝 茶多酚工业废液中含有占干重２％左右的茶氨
酸，同时还有可溶糖、蛋白质、多酚及色素等杂质（见 表１）。这些杂质在废液中以悬浮及胶体态存在，影 响茶氨酸的提取纯化，因此在对茶氨酸进行纯化时， 必须对废液进行预处理，降低废液中蛋白质等杂质 的含量，使溶液澄清。在工业中常用的澄清方法是 絮凝与高速离心。离心法能耗大，设备价格昂贵，在 实际生产中难以广泛应用［７，８］。本实验采用絮凝法 来澄清废液，考虑到用离子交换柱来进一步纯化时 所需的茶氨酸的上柱浓度，将废液配成１０％（ｗ／ Ｖ）的溶液。采用明胶、聚丙烯酰胺等进行絮凝实 验时，絮凝效果不佳，当采用壳聚糖作为絮凝剂时有 较好的絮凝效果。为了进一步优化絮凝工艺，考察 了溶液的ｐＨ、壳聚糖絮凝剂用量、温度对絮凝效果 的影响。 ２．１．１ ｐＨ值对絮凝效果的影响
在烧杯中加入一定浓度的茶多酚工业废液，用
１ ｍｏｌ／Ｌ稀盐酸调节ｐＨ值。在搅拌下缓慢加入絮
凝剂，使其完全混合均匀，然后慢速搅拌养絮，直至
絮凝反应结束。以溶液的吸光值（Ｏ．１３６５０）的变化 及茶氨酸的回收率作为絮凝效果评价指标。
１．４．２吸附实验
取１０ ｍＬ吸附材料于三角瓶中，加入待处理液
５０ ｍＬ，水浴摇床中平衡２ ｈ，过滤分离去除吸附剂，
茶多酚工业废液用１ ｍｏｌ／Ｌ的稀盐酸调节至不 同的ｐＨ值，添加１％的壳聚糖絮凝剂至溶液壳聚糖 浓度为３ ｍｇ／ｍＬ，观察絮凝效果。结果如图１所 示，当溶液ｐＨ值介于３．０～４．０之间时，絮凝清液
天然产物研究与开发
光密度Ｏ．Ｄ６５０值降到０．４左右，当ｐＨ值大于４．０ 时絮凝效果明显变差。溶液ｐＨ值对茶氨酸的回收 率影响不大。考虑到茶氨酸在大于３．０时较稳定， 因此将废液的ｐＨ值控制在３．０左右。
２００４ Ｖ０１．１６ Ｎｏ．５
林智等：茶氨酸提取纯化工艺研究
１．２仪器设备
Ｂｕｅｈｉ Ｒ．１２６旋转蒸发仪；Ｓｈｉｍｉｄｚｕ ＵＶ一２５５０
分光光度计；Ｏｒｉｎｏｎ８１８酸度计；Ｗａｔｅｒｓ液相色谱
仪；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ高速离心机；ＹＺｌ５１５恒流泵 （保定兰格恒流泵有限公司）；Ⅸ、Ｚ一１００分部收集器
量，计算树脂对茶氨酸的吸附容量。吸附容量ｑ＝Ｖ
（Ｃ（１一Ｃ）侧（式中ｑ为树脂重量交换容量（ｍｇ／ｇ树
脂），Ｖ为溶液的体积（Ｌ），Ｃｏ初始液中待测物的浓
度（ｍｇ／Ｌ），Ｃ为平衡时待测物的浓度（ｍｇ／Ｌ），Ｗ为
湿树脂的重量（ｇ））。
（２）动态交换实验：转Ｈ＋型的７３２树脂装柱
（观０×２００ ｍｍ）后用缓冲液平衡，样液调ｐＨ后上
ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｒｅｍｏｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ；Ｃａｔｉｏｎ ｉｏｎ—ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ ｃａｎ ａｄｓｏｒｂ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｐｅｃｉａｌｌｙ．Ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ｔｈｅａ。
４．６ ｍｍ）色谱柱；柱温３０℃；进样体积１０止；流速
１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；流动相Ａ：ｐＨ ６．４的６０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ—ａａｃ缓冲液，流动相Ｂ：乙腈：水（１：１，ｖ：ｖ）， Ｂ相在２０ ｍｉｎ内从０至１００％；检测器Ｗａｔｅｒｓ ２４８７，３６０ ｎｍ。
茶多酚含量的测定：酒石酸铁比色法［５｜。 可溶性糖含量测定：蒽酮比色法【５］５。 蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝法旧６。 吸光度的测定（Ｏ．Ｄ６５０）：样品过滤后在波长 ６５０ ｎｍ下测定其吸光值，以蒸馏水作参比。
表１茶多酚工业废液中茶氨酸及其他物质的含量（％）
Ｔａｂｌｅ １
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｗａｓｔｅ ｌｉｑ— ｕｉｄ（％）
茶氨酸 可溶性糖蛋白质茶多酚其他
Ｔｈｅａｎｉｎｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＰ
Ｏｔｈｅｒｓ
茶多酚工业废液
Ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ－
２．１
ｄｍｔｆｉａｌ ｗａｓｔｅ ｌｉｑｕｉｄ
１６．２
２５．６ ２２．５ ３１．８
ｌ ｌ ｌ ｌ
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Ｏ —ｒＩ目＼Ｍ目一ＳⅧ目Ｑ告Ｊｏ口¨＿昱ｇｏｕ
ｐＨ
图１ ｐＨ对絮凝效果的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｆｌｏｃｃຫໍສະໝຸດ Baiduｌａｔｉｏｎ
２．１．２壳聚糖加入量对絮凝效果的影响 调节茶多酚工业废液ｐＨ值为３．０，添加不同量
ｎｉｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅ—ｃｒｙｓｔａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅａｎｉｎｅ ｗｅｒｅ ０，８％ ａｎｄ ９０％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｔｈｅａｎｉｎｅ；ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ；ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ；ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ；ｒｅ—ｃｙｓｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．
收稿日期：２００４，０３—１８
接受日期：２００４．０５—２５
基金项目：浙江省科技计划重点项目“茶氨酸提取制备产业化技 术研究”（２００２Ｃ２１０２３）
＊通讯作者Ｔｅｌ：８６—５７１—８６９７１２６２
万方数据
茶氨酸，不仅产品成本相对较低，而且可以很好的解 决茶多酚生产厂家的工业废液的出路问题，具有较 好的应用前景。本文系统研究了从茶多酚工业废液 中提取纯化茶氨酸的工艺。
摘要系统研究了从茶多酚工业废液中提取纯化茶氨酸的工艺。采用絮凝、吸附、阳离子树脂交换、重结晶 工艺来分离纯化茶氨酸。结果表明，絮凝能有效的去除茶多酚工业废液中的蛋白质等杂质，杂质的去除率为 ５０％；吸附能进一步去除色素、多酚类物质及大分子有机物；阳离子交换树脂能较专一吸附氨基酸。茶多酚工 业废液经絮凝一吸附一阳离子树脂交换工艺可得纯度５０％的茶氨酸，得率为１．８％；通过重结晶可得到纯度 ９０％的茶氨酸，得率为０－８％。 关键词茶氨酸；絮凝；吸附；离子交换；重结晶；纯化