非洲猪瘟实验室诊断

荧光PCR检测病毒DNA
荧光PCR工作单
样品的可追溯性！
2017/5/15
荧光PCR检测病毒DNA-试剂准备
➢病毒DNA提取试剂盒
➢非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒
荧光PCR检测病毒DNA-试剂制备
➢冻干蛋白酶K: 将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的
蒸馏水中，将溶液以500 µl分装，在 <- 10ºC温度下 储存，直到使用。
• 第一步
– 实验前清洁试验区域（台面、移液器等） – 注意消毒剂的期限
• 第二步划分不同的区域
– 样品处理（BSL-3提取病毒DNA） – PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等） – ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等）
2017/5/15
GLP (good laboratory practice)
• 抗凝血 • 淋巴结 • 脾脏 • 肾脏 • 骨髓
实验室诊断的安全原则
• 保障人员的安全
– 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等 – 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食
物和饮料等 – 了解化学试剂的特性和潜在的危险
• 保障样品的安全
– 防止样品交叉污染 – 一次性手套
2017/5/15
良好的工作区域
临床症状
➢最急性型 ➢急性型 ➢亚急性型 ➢慢性型
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临床诊断
最急性型
• 无临床症状，突然死亡
急性型（强毒株）
• 发烧（41-42°C） • 食欲减退 • 不愿活动 • 局部皮肤变红或变蓝色 • 腹泻 • 呕吐 • 呼吸困难 • 流产 • 死亡率高（10-100%）
仔猪发生ASF，耳、鼻、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。 Mityana, Uganda, 2010
非洲猪瘟实验室诊断
African Swine Fever, ASF
国家外来动物疫病研究中心 中国动物卫生与流行病学中心
定义
非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传 染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。
——世界动物卫生组织
• 可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式
• 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关
荧光PCR检测病毒DNA-样本处理
➢组织样本
取100 mg组织剪碎，加入1 ml PBS研磨或匀浆，然后1050 g或2000 rpm离心10分钟取上清
➢全血（抗凝血）或血清
直接吸取200 µ l
提取病毒DNA
• 将200 µl结合缓冲液（绿盖）和40 µl蛋白酶K（20 mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。
– 基于半纯化病毒抗原
2. 商业化ELISA试剂盒
– INGEZIM PPA COMPAC K3 (INGENASA)使用 VP73特异性单抗的阻断ELISA
– SVANOVIR 间接ELISA（重组抗原p30蛋白） – ID Screen 间接ELISA（包被p32、p62和p72蛋白）
图17：肺实变区（慢性ASF）
图18：心包脏层附有纤维素， 而且可见出血点（慢性ASF）
鉴别诊断
• 高致病性蓝耳病 • 猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引起 • 细菌性败血症 • 香豆素中毒 • 真菌毒素中毒 。。。。
2017/5/15
ASF感 染 的 主 要 特 征
猪 (野猪和家猪) 软蜱
图9：肾淤斑及出血点（急性） 图10：肾盂及肾乳头部的出 血斑（急性）
图11：肾盂处散在的出血点（急性ASF ） 图12：肿大、出血的肝胃淋巴结，可出见有血凝块。（急性）
图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF） 图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF）
图15：胆囊水肿（急性ASF） 图16：肺部可见肉芽肿病变， 形成一结节（慢性ASF）
临床诊断
各种毒力的毒株均可导致流产
• 胎儿可能全身水肿 • 胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点
➢病理诊断
诊断
脾脏
肿大 易碎
暗红色至黑色
胃、肝、肾各部位淋巴结肿 大、出血；
水肿
➢肺、肝、膀胱 ➢胆囊充盈 ➢结肠系膜
出血
➢瘀点 ➢瘀斑
肾皮质出血点、出血斑
肺部局部肉芽肿，形成结节
慢性型
肺局部肉变，实变
• 扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 µl冲洗缓冲液加入过滤管 ，以8000 g进行1分钟离心操作）。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的1.5 ml微离心管中。
提取病毒DNA （3）
• 将50 µl—100 µl预热的消毒蒸馏水加入过滤管（ 注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以8000 g 进行1分钟离心操作。
临床诊断
亚急性型（中等毒力毒株）
• 症状同急性型，但较轻 • 死亡率低 • 持续时间长（3周）
慢性型（低毒力毒株）
• 消瘦或发育迟缓，体弱 • 偶见体温升高，波状热 • 呼吸困难，湿咳 • 怀孕母猪流产 • 多处皮肤局部红斑、溃疡 • 耳部、腹部、大腿内侧可能凸起或坏死 • 易继发感染，如继发引起肺炎和关节炎 • 感染后能康复，但终身带毒 • 死亡率低，可见血清转阳
• 将DNA溶液在<-10ºC温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR 操作，在4 ± 3 ºC 温度下短暂储存，然后冻存。
荧光PCR检测病毒DNA—OIE方法
配制反应体系： ➢ 反应液溶解后，每个反应管中加入18 µl反应液，
然后再加入2 µl模板； ➢ 每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反
2017/5/15
实时荧光RPA检测ASFV
• 特异性强
– 与其他病毒无交叉反应
• 敏感性高
– 能检测出不同基因型的毒株
2017/5/15
实时荧光RPA检测ASFV
• 与荧光PCR具有较高的相关性 • 概率回归分析：最低可检测出17个拷贝
2017/5/15
ASFV的基因型
➢22个基因型 ➢非洲22个型：西非I型为主，东非基因型复
• 将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中， 重复离心操作。
• 扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。
• 将500 µl除抑制物缓冲液（黑盖）放入过滤管，以8000 g离心 1分钟。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。
• 将500 µl冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。
纤维素性心包炎，并可见出血点
图1：ASF 猪尸体底部的发绀病变。图2：耳尖的发绀病变。
图3： 血性腹泻 （血痢）。
图4：急性ASF 死猪肺小叶间的水肿。
图5：胃的基底膜淤血（急性） 图6：典型肿大脆化脾。 （黑浆果脾，急性ASF）
图7：病猪脾（上）与正常脾大小的比较。（急性ASF） 图8：急性ASF 猪肿大的褐色脾。（巴西品种）
应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水）
荧光PCR检测
程序设置
荧光PCR检测病毒DNA-实验结果
荧光PCR检测病毒DNA-结果判定
➢ 有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的 Ct值应小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性对 照（R-）无Ct值，则试验有效。
➢ 阳性和阴性：当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且 Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在背 景信号之下或Ct值≥37时，判定为阴性结果。
• 加入200 µl样本。每个提取程序都加入E+ 和 E(200 µl水)对照。
• 立即混匀并在72±2ºC 温度下孵育10分钟。 • 将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的
水珠。 • 将100 µl异丙醇加入样本试管，混匀。 • 将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。
提取病毒DNA （2）
– Asfarviridae Asfivirus ASFV
– 兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 – 唯一核酸为DNA的虫媒病毒 – 只有一个血清型
病原
➢ 特点之一：基因组大
蓝耳病病毒 15kb 12 倍
170~190kb
猪瘟病毒 12kb 15 倍
Genome CSFV
口蹄疫病毒 8kb 24 倍
Genome FMDV
2017/5/15
分子生物学检测方法
O20u17r/a5,1/C5. A., L. Edwards, and C. A. Batten. 2013. Virological diagnosis of African swine fever--comparative study of available tests. Virus research 173:150-158.
• 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100%
• 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分 • 目前没有疫苗！！！
2017/5/15
• 只感染猪 • 家猪和欧亚野猪非常易感
– 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者
• 非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且 没有临床症状
病原
➢特点之二：基因多变
基因组两端各有一个高变区，基因型多达22个
病原
➢ 特点之三：抵抗力强
温度：
60℃ 20分钟；
56℃ 70分钟
25-37 ℃ 数周
4℃ 冻肉
>1年 数年到数十年
乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活
pH：
4——11.5 无血清 4——13.4 有血清 未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活
• 软蜱是自然界中的贮主并且可以作为传播 媒介
• 法典中将非洲猪瘟的潜伏期定为15天。
2017/5/15
重要性
• OIE动物卫生法典要求必须报告的动物疫病 • 我国动物疫病名录一类动物疫病 • 我国《中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》
明确重点防范的外来动物疫病
病原
– 非洲猪瘟病毒科中唯一成员
➢除抑制物缓冲液: 将20 ml无水乙醇加入原始小瓶
中混匀并进行相应的标记和日期记录。室温储存。
➢冲洗缓冲液: 将80 ml无水乙醇加入原瓶中混匀并
进行相应的标记和日期记录。室温储存。
荧光PCR检测病毒DNA-仪器设备
➢水浴锅或金属浴 ➢匀浆仪和匀浆管（陶珠） ➢台式离心机 ➢荧光PCR仪 ➢移液器
双抗体夹心ELISA测 定ASFV抗原
实验室诊断
血清学
间接ELISA测定ASF 特异性抗体
阻断ELISA检测ASF 特异性抗体
免疫印迹
间接免疫荧光测抗体
唯一确诊单位：国家外来动物疫病研Βιβλιοθήκη Baidu中心
血清样品
实验室诊断
×
合 格 血
液
样
析
品
出
的
血
不合格血液样品
清
分离好的血清单独 包装，并一一编号
实验室诊断
病原学样品
杂 ➢欧洲- I型意大利撒丁岛，II型东欧和俄罗斯
2017/5/15
2017/5/15
血清学检测方法
➢没有疫苗！
抗体=感染
➢没有中和抗体。
➢感染早期既可以检测出抗体（712dpi）
➢抗体持续很长时间
2017/5/15
血清学检测方法
筛选（Screening by ELISA tests） 1. OIE-ELISA 间接ELISA
建立了猪瘟、非洲猪瘟的荧光定量PCR鉴别诊断方法
257bp
278bp
英国Pirbright 实验室比对实验
双抗体夹心ELISA检测抗原
阻断ELISA检测抗体
间接ELISA检测抗体
间接ELISA检测病毒抗原
商品化试剂盒INGEZIM K3 (Ingenasa, Spain)
– 价格比PCR便宜 – 不需要复杂的操作 – 适用于基层实验室 – 敏感性低（慢性或亚急性）
• 原则
制定一整套标准以确保质量、可靠性和完整性， 可核查结论和可追溯性数据的报告。
• 要点
– 资源：组织、人员、设施和设备 – 特征：检测项目和测试系统 – 规则：试验步骤、标准操作程序（SOP） – 结果：原始数据、最后报告和档案 – 质量保证：独立监测的研究过程
2017/5/15
实验室诊断技术储备
➢ 可疑样品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。
实时荧光RPA
• 重组酶聚合酶扩增技术 • 等温扩增（37~42°C） • 用时短：20分钟 • 灵敏度高 • 操作简单，便携式仪器
感染
表现出临床症状
携带者
Virus
Ab
病毒血症: 感染后2-3天到8天，持续很长时间（数月） 特异性抗体: 从感染后的7-11天至数月，甚至数年 排毒:从 感染早期（第2天）以后持续很长时间。甚至康复后。
实验室诊断
病原学
病毒分离— 血细胞吸附试验 直接免疫荧光法
（FAT） 普通PCR和荧光定量
PCR