新基因功能研究的策略与方法分析
基因测序技术的操作方法与分析策略
基因测序技术的操作方法与分析策略基因测序技术的快速发展使得人们能够更深入地了解生物体内基因的组成和功能。
它不仅在医学诊断和治疗上起到了重要作用，还在农业育种和环境保护等领域有广泛应用。
本文将介绍基因测序技术的操作方法和分析策略，旨在帮助读者更好地理解和使用这一技术。
一、基因测序技术的操作方法基因测序技术可以分为传统的Sanger测序和高通量测序两种方法。
传统的Sanger测序主要依靠荧光原位杂交技术进行，而高通量测序则采用了二代测序和第三代测序技术。
1. 传统的Sanger测序方法在传统的Sanger测序方法中，DNA片段首先被引物引导合成，形成不同长度的DDN基因片段。
然后，这些片段通过凝胶电泳分离，并使用荧光探针对其进行检测。
最后，测序结果会通过电泳图进行分析和解读。
2. 高通量测序方法高通量测序方法通过平行测序大量不同的DNA片段，从而实现了对整个基因组的测序。
目前常用的高通量测序技术主要包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序和Nanopore测序等。
Illumina测序是目前应用最广泛的高通量测序技术之一。
该技术通过将DNA片段连接到测序芯片上的特定位置，并进行多轮的合成和测序，最终得到高质量的测序结果。
Ion Torrent测序则是利用DNA链延伸的过程中产生的氢离子释放来进行测序。
这种方法速度快、成本低，并且适用于小规模测序项目。
PacBio测序利用了DNA链扩增和电泳分离的技术，可以获得较长的读取长度，并用于研究基因组的结构和变异。
然而，其测序错误率相对较高。
Nanopore测序技术则是通过将DNA片段通过纳米孔进行测序，通过对电流的变化进行分析和解读，进而得到基因序列信息。
这种方法具有实时性、易于操作等优点。
二、基因测序技术的分析策略基因测序技术的快速发展不仅使我们能够快速获取基因组信息，还需要相应的分析策略来对这些数据进行解读。
1. 数据质量控制在基因测序过程中，数据的质量控制非常重要。
基因功能研究的整体解决方案
BamHI
Sal I
Bgl II
XhoI
Sal I
2
BamHI
Bgl II
XhoI
Sal I BamHI
1
2
Bgl II XhoI
A）miRNA的串联
B ）miRNA串联试验结果
13
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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miRNA载体特点-组织特异性表达miRNA
9
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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BLOCK-iT™ miR RNAi Select
1. BLOCK-iT™ miR RNAi Select ：在Invitrogen网站的数据库里边 有已经设计好了的针对不同基因的oligo DNA（4对/一套）； Oligo DNA可以用来插入到BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression载体里边，进行RNAi研究。
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RNAi Vector + RNA合成
standard siRNA
(21-mer overhangs)
Stealth™ RNAi
(25-mer blunt)
shRNA expression
miRNA expression
5
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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体外合成RNAi vs. RNAi载体
体外合成RNAi 长效稳定沉默 RNAi载体
可调控的沉默
导入到难转染的细胞 沉默效果快速而强力 最高特异性 容易操作
遗传性疾病诊断中基因变异分析的方法和策略
遗传性疾病诊断中基因变异分析的方法和策略基因变异是指基因序列中发生的突变或改变，它是导致遗传性疾病发生的重要原因之一。
针对遗传性疾病的诊断和预防，基因变异分析是一种常用的方法和策略。
通过对个体的基因序列进行分析，可以帮助医生确定患者是否携带有致病基因，从而为疾病的早期诊断和治疗提供有力支持。
基因变异分析方法的选择和策略的制定需根据疾病的特性和遗传模式来确定。
目前常见的基因变异分析方法包括：Sanger测序、下一代测序（NGS）、聚合酶链反应（PCR）和寡核苷酸探针芯片等。
其中，下一代测序是目前应用最广泛的一种方法。
它可以高通量、高准确性地获取个体的基因组信息，包括常见和罕见的变异。
相比传统的Sanger测序，下一代测序不仅具有更高的分辨率，还可以同时检测多个基因，提高基因变异分析的效率。
基因变异分析的策略通常是根据疾病的类型和遗传模式来选择。
对于单基因遗传病，如囊性纤维化和先天性肌萎缩症等，策略是首先针对特定的致病基因进行检测。
这可以通过全外显子测序或者寡核苷酸探针芯片来实现。
如果已经明确患者的家族史，基因检测的策略可以根据患者家族史的特点来制定，例如先进行特定位点的突变筛查，再通过全外显子测序进行进一步分析。
对于复杂疾病，如常见疾病和多基因遗传病，策略较为复杂。
常见疾病通常涉及多个基因和环境因素的相互作用，例如糖尿病和高血压等。
在这种情况下，基因变异分析的策略主要是通过关联分析和基因组学的方法来识别与疾病相关的基因。
通过比较患者群体和健康对照群体的基因组信息，可以发现与疾病相关的位点和基因。
此外，基因变异分析还可以利用家系分析和同源性重组等方法来研究基因的遗传规律和变异的发生。
家系分析可以帮助确定变异基因的遗传模式，从而提供疾病的遗传风险评估。
同源性重组则通过观察基因组中的重组事件来研究遗传变异的发生机制。
在进行基因变异分析时，需要注意的是疾病的遗传异质性和基因本身的变异性。
不同个体之间基因变异的差异可能较大，因此需要确保选择正确的分析方法和策略。
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异所致的疾病，其研究策略和方法主要包括以下几个方面：1.基因组关联分析（GWAS）GWAS是一种广泛应用于多基因遗传病研究的方法，它通过对大量样本进行基因组分析，寻找与疾病相关的基因位点。
GWAS可以发现与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定疾病的遗传风险因子。
GWAS的优点是可以发现新的遗传变异，但其缺点是只能发现单个基因的影响，而无法考虑基因之间的相互作用。
2.基因组学数据整合分析基因组学数据整合分析是将不同来源的基因组学数据整合起来，以发现与疾病相关的基因和通路。
这种方法可以将GWAS、转录组、蛋白质组等多种数据整合起来，从而更全面地了解疾病的遗传机制。
3.基因组学功能研究基因组学功能研究是通过对基因的功能进行研究，以了解其在疾病发生和发展中的作用。
这种方法包括基因敲除、基因表达调控、蛋白质相互作用等实验手段，可以揭示基因在疾病中的作用机制。
4.系统生物学分析系统生物学分析是将基因组学数据与生物学网络相结合，以了解基因之间的相互作用和通路。
这种方法可以揭示疾病的复杂性和多样性，从而为疾病的预防和治疗提供新的思路。
总之，多基因遗传病的研究需要综合运用多种方法和技术，以全面了解疾病的遗传机制和发展规律。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
新基因功能研究的策略和方法
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利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
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此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
新基因全长cDNA的克隆策略
随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成, 生命科学 已经进入了后基因组学时代(post genomics)。 在对基因组结构进一步了解的
同时,功能基因组学逐渐成为核心内容. 基因组序列测定的完成仅仅是基因组
计划的第一步, 更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与 表达规律。 因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题, 它将是21 世纪生命科学研究的重要领域. 那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基 因功能的研究方案从而进行全面和系统的研究是每个基因功能研究者面相 似的基因。
• 如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用 RACE(cDNA 末端快速扩增)或反向
PCR和锚定 PCR方法克隆该基因的 cDNA全长序列的引物进行序列分析。
• 所有DNA片段；
• 2.连接至载体；
• 3.转化到受体细胞扩增；
• 4.目的序列的筛选鉴别。
• 如果已知一个基因的序列，那么可以通过已知序列设计引物，然后通过PCR技术获 得目标DNA片段。
• 如果一个或多个物种的某种基因已经被分离，可以通过同源性对比找到的保守性
• 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳
到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基 因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时， 失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起。由转座子引起的突变便可部分突变株DNA序 列的克隆，。
• 目前基因功能的基本策略： • 1 .新基因全长 cDNA的克隆策略； • 2 .通过生物信息学预测新基因的功能； • 3 .新基因的表达谱分析；
基因功能分析的基本策略-硕士
化学合成
质量高，高纯度，高成本 适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 不适于筛选靶点序列
体外转录
成本适中，省时，适用于筛选靶点序列 不适用于长期的研究或者针对某个特定靶 点序列的大量研究
长片断dsRNA酶解法
dsRNA在体外被RnaseⅢ家族 成员切割成siRNA 不需要验证筛选多个靶点序列 不适用于长期研究或者特定 siRNA序列的研究
Embryonic Stem Cells
同源重组
5´ 3´ 3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´
5´
3´
3´ 5´
target
targeting vector
TK
homologous recombination
5´ 3´
“knockout”
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
AAACCAGCAGAACGTGTACGA
载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点
操作简便，稳定性好 siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于 研究 适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选 标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株
目的基因mRNA获取：
1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）
2、/ 3、其它网站
载体构建：
dsDNA形成：退火 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定
转染：瓶颈之一
含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志
效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾
RNA
translation
Protein
基因功能分析的基本策略
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
13、乍见翻疑梦，相悲各问年。。22.8.722.8.718:19:4518:19:45August 7, 2022
14、他乡生白发，旧国见青山。。2022年8月7日星期日下午6时19分45秒18:19:4522.8.7
15、比不了得就不比，得不到的就不要。。。2022年8月下午6时19分22.8.718:19August 7, 2022
Cre／loxP系统的原理
➢ Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的 DNA重组。 ➢该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有 两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段 34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。 ➢②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343 个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。 任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在 Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)， 要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
一、反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根 据反义RNA的作用机制可将其分为三类： 1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制 mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象的变化，从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶 mRNA的转录。
新基因功能研究的策略与方法
生物进化与物种多样性研究
基因功能研究在 生物进化研究中 的应用
基因功能研究在 物种多样性研究 中的应用
基因功能研究在 生物适应性研究 中的应用
基因功能研究在 生物系统发育研 究中的应用
未来展望与挑战
新技术与新方法的探索与应用
基因编辑技术：CRISPR/Cs9 等基因编辑技术的应用
单细胞测序技术：单细胞测序 技术的发展与应用
THNK YOU
汇报人：
基因功能研究的应用
ห้องสมุดไป่ตู้
疾病发生发展机制研究
基因功能研究在疾病发生发展中的作用 基因功能研究在疾病诊断中的应用 基因功能研究在疾病治疗中的应用 基因功能研究在疾病预防中的应用
药物靶点筛选与新药研发
药物靶点筛选：通过基因功能研究确定药物作用靶点 新药研发：基于基因功能研究开发新型药物 药物筛选：通过基因功能研究筛选出有效药物 药物优化：根据基因功能研究优化药物结构和剂量
生物信息学方法：生物信息学 方法在基因功能研究中的应用
人工智能技术：人工智能技术 在基因功能研究中的应用前景
数据整合与共享的重要性
提高研究效率：通过数据整合可以减少重复工作提高研究效率
促进合作与交流：数据共享可以促进研究人员之间的合作与交流共同推 进科学研究
提高研究质量：通过数据共享可以避免数据重复使用提高研究质量
基因过表达： 通过基因工 程手段增加 基因的表达 量观察其对 生物体的影 响
基因沉默： 通过RN干扰 技术抑制基 因的表达观 察其对生物 体的影响
基因突变： 通过基因编 辑技术引入 基因突变观 察其对生物 体的影响
基因表达分 析：通过基 因芯片、高 通量测序等 技术分析基 因的表达情 况了解其功 能
基因组学研究的新技术与新方法
基因组学研究的新技术与新方法随着科技的不断发展，基因组学研究也在快速进步着。
从最初的Sanger测序到现在的高通量测序技术，基因组学研究不断涌现新的技术与方法。
本文将介绍一些基因组学研究的新技术与方法，并探讨其在基因组学研究中的应用。
一、单细胞测序技术单细胞测序技术是指通过对单个生物细胞进行基因组、转录组或表观基因组的测序，获得该细胞的完整信息。
相比于传统的混合细胞测序，单细胞测序技术具有更高的分辨率和灵敏度。
单细胞测序技术主要分为两种，一种是单细胞全基因组测序技术（single-cell whole genome sequencing，scWGS），另一种是单细胞转录组测序技术（single-cell transcriptome sequencing，scRNA-seq）。
在scWGS技术中，通过将单个细胞的基因组DNA进行扩增、建库和测序分析，可以获得单个细胞完整的基因组信息。
而在scRNA-seq技术中，则是将单个细胞的mRNA转录本进行扩增、建库和测序分析，获得单个细胞转录组的信息。
单细胞测序技术在各个领域都有着广泛的应用，如在肿瘤学中可以研究不同癌细胞的异质性，从而更好地了解癌症的发生机制和治疗策略；在演化生物学中可以深入研究物种的起源和演化；在发育生物学和神经科学中则可以探究单个细胞发育及神经元分类等问题。
二、DNA甲基化测序技术DNA甲基化是指DNA分子上甲基在胞嘧啶环上发生加成反应，从而形成5-甲基胞嘧啶。
这种化学修饰是细胞表观基因组调控的一种重要方式。
DNA甲基化测序技术是指对DNA分子进行甲基化信息的测序，以描绘基因组DNA上甲基化分布情况。
这类测序技术主要包括甲基化敏感限制性内切酶测序（methyl-sensitive restriction endonuclease sequencing, MRE-seq）、嵌入式甲基化测序（bisulfite sequencing, BS-seq）和甲基化免疫沉淀测序（methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq）等。
基因功能研究
基因功能研究基因是生物体内携带基本遗传信息的分子，它决定了生物体的性状和功能。
基因功能研究是科学家为了深入了解基因的作用，从而揭示生物体的生理和生化过程的一门科学。
基因功能研究对于人类的健康和疾病治疗有重要的意义。
基因功能研究主要通过以下几个方面来进行：首先，基因表达的研究。
基因的表达是指基因的信息以RNA为中介被转录成蛋白质的过程。
通过研究基因表达，可以了解基因在不同细胞类型和组织中的表达模式，以及在不同生理和病理状态下的表达变化。
这对于揭示基因的功能和调控机制非常重要。
其次，基因功能的破坏与修复研究。
通过研究特定基因的缺失或突变对生物体的影响，可以揭示该基因在生理过程中的作用。
例如，某个基因突变可能导致某种疾病的发生，通过研究该基因突变对生物体的功能影响，可以找到治疗这种疾病的新靶点。
再次，基因功能调控的研究。
基因的功能调控包括转录调控、转录后调控、转译调控等多个层面。
通过研究调控元件（如启动子、增强子等）和调控因子（如转录因子、组蛋白修饰酶等），可以了解调控网络的组成和运行机制，从而进一步理解基因的功能和调控网络在疾病中的异常变化。
最后，基因功能与疾病关联的研究。
许多疾病包括遗传性疾病和复杂性疾病都与基因功能异常有关。
通过研究基因与疾病之间的关系，可以寻找新的疾病标志物、诊断方法和治疗策略。
例如，通过研究肿瘤个体基因组，可以找到与肿瘤发生和发展相关的新靶点和药物。
总之，基因功能研究是生命科学研究的重要分支之一。
通过深入研究基因的作用和调控机制，可以为疾病的预防、诊断和治疗提供新的思路和方法。
随着技术的发展和研究的深入，相信基因功能研究将会在人类健康和疾病治疗领域发挥越来越重要的作用。
基因功能分析策略
欧盟国家总面积不到２０万公顷，０.３％左右。
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各國GMO作物栽培面積的變遷
(藍色者為全球統計)
百 萬 公 頃
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Research on Transgenic Corn
转基因玉米研究
antigen against an E.coli
toxin.
Part of the Plant Science Institute Biopharmaceutical Initiative
Feeding antigencontaining corn to mice
protected them against E. coli enterotoxin and
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转基因玉米
抗虫害的玉米
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和 工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如 今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。
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转基因小麦
从植物体中分离出 合成赖氨酸的基因，把 这基因转入小麦植株中， 培育出转基因小麦。用 这种转基因小麦制造出 来的面粉，更适合用来 烤面包，而且面粉中赖 氨酸含量高，这种面包 的营养价值高。
4．胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射
入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动 物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁 育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。
精选课件
转基因动物的应用前景
1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现 象的内在本质。
2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理 及治疗方法。
基因突变产生的创新与功能改变分析
基因突变产生的创新与功能改变分析基因突变是指在基因组中发生的突发性的变异现象，这种变异可以导致突变基因的DNA序列发生改变，从而使得基因本身的功能发生变化。
与此同时，基因突变还有可能导致某些基因的部分或全部功能的丧失，或者将其增强到原来未曾有的程度。
突变是自然选择和进化的重要推动力量。
对于生物体而言，基因的突变既是一种可能带来危险的生物学现象，同时也是创新与进化的基础。
不同物种在进化的过程中，基因突变总会带来不同的变化，使生物体能够适应环境中的新变化与挑战。
本文将探讨基因突变对于生物体的创新与功能改变的影响，并从分子基因的角度来探索这种现象的原理。
生物的创新与进化生命的演化是一种自下而上的过程，即基因突变的累积与整合在某种程度上，推动了生命进化的发展。
在进化过程中，物种通常在自身基因组的水平上发生重大调整，产生新的基因，或者通过调整已有的基因，使其更适应生物体所处的环境。
生物的DNA上存储了生物的基因，基因通常是每个生命体的遗传物质的构成要素。
而基因的突变，不是靠自主产生，而是受到环境因素、遗传因素或者随机性的影响。
这样的变化让生物有机会产生新的结构，新的生理功能和新的生存策略。
比如，在人类进化的过程中，基因突变在很大程度上推动了人类的发展。
在过去数千年中，从非洲大草原迁徙至各个地球角落的人类，通过基因突变和预见性进化，被赋予了各种新的能力。
比如，在低酸性水体中生长的鲑鱼，可以调整其视网膜中的色素数量，以更好地适应相应的光线环境。
这个适应性增强的过程，也是从基因突变中诞生的。
因此，基因突变是生物的创新与进化的基石。
基因突变与新功能的产生随着生物基因技术的不断进步，人们在基因序列级别上对基因突变和新功能的产生有更深入的认识。
在分子生物学的研究中，我们发现基因突变孕育的新功能涉及很多方面。
首先，基因突变在DNA序列水平上破坏了某些或所有的元素，这些元素对于基因在生物体中的正常活动是必不可少的。
这样会导致基因对功能性结构、蛋白质和RNA聚合物的产生变化，从而促使生物体在特定的生态环境中获得更好的适应性。
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拟南芥中鉴定到一个F-box 蛋白——AtPP2-B11，在延 长盐处理时间时，其转录 水平和蛋白水平均出现显 著诱导表达。过表达 AtPP2-B11的转基因拟南芥 表现出明显的高盐耐受性， 而相应的RNA干扰株比野 生株对盐胁迫更敏感。 iTRAQ定量分析显示，在盐 胁迫下有4311个差异表达 蛋白受到AtPP2-B11调控。
细胞及动物水平验证
• 基因过表达细胞模型 • 基因沉默细胞模型
基因过表达细胞模型
•定义：通过载体将目的基因转入某一特定细 胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为 的变化，从而了解该基因的功能。 •应用：1）化学法 细胞感染
2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行 转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反 应，从而影响目的基因表达。
研究基因的时空表达模式
• mRNA水平的表达谱分析 • 蛋白水平的表达谱分析
mRNA水平的表达谱分析
• Northern Blotting • 原位杂交 • RT-PCR • cDNA微阵列
蛋白水平的表达谱分析
• Western Bloting • 免疫组化技术 • 双向凝胶电泳 • 生物质谱技术
新基因功能研究的策略与方法
目录
• 生物信息学预测 • 研究基因的时空表达模式 • 细胞及动物水平验证
生物信息学预测
• 序列相似性分析 • DNA序列的开放阅读框查找 • 蛋白质理化性质分析
序列相似性分析
相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系
同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质
序列具而共同祖先的结论，属于质的判断
序列间的相似性越高，是同源序列可能性就 更高
核苷酸序列相似性分析
BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的 序列
序列决定结构，结构决定功能
氨基酸序列相似性分析
BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索 蛋白质数据库中的序列
/BLAST
12
• 限制性核酸内切酶切位点 • 外显子、内含子剪切位点分析
蛋白质的理化性质分析
氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏水性、 亲水性、极性、电荷分布等基本理化特性
/protparam
疏水性分析
ExPASy的ProtScale程序 /cgi-bin/protscale.pl 蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基 酸，对蛋白质的三级结构有重要影响 可用来计算蛋白质的疏水性图谱
研究基因的时空表达模式
基因表达的时空性是指基因的表达在个体 发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细 胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、 衰老等生命现象的分子基础。
基因表达的时空性特征为基因功能的研究 提供了重要的信息：如果基因在某一特定的 正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表 示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作 用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表 达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、 发展有关。
是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的 特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因 表达，以达到调控表达基因的目的。ASON 一般设计在编码区或3’非编码区，长度以 15~20nt较为合适。ASON包括反义DNA和反 义RNA。
RNAi技术
• 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的 dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达 到阻止基因表达、产生“功能失活”的目 的。
• 优势（与ASON比较）：操作简单、投入少、 周期短；用于研究特定基因在特定组织细 胞的特定发育阶段中的功能。
细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在 Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解 开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合 物（RISC）中； 装载了小RNA的RISC复合物就会在 细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA 靶分子；被装载入RISC复合物当中的向导链-ssRNA随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶 （Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列 的mRNA靶分子。
反义技术
•原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工 或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段（或 其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转 录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节， 抑制或封闭靶基因的表达，从而调节细胞的 生长分化等。
•分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNA
ASON技术（反义寡核苷酸技术）
• 蛋白跨膜结构分析 • www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM • 信号肽预测与识别 • www.cbs.dtu.dk/services/signalP • 蛋白质卷曲螺旋预测 • /software/COLIS_form.ht
ml • 磷酸化位点预测与识别 •
基因沉默细Leabharlann 模型• 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破 坏靶基因组
• 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰
基因沉默在人细胞作用模式
• 第一种为RNA-RNA 模 型其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成 的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。
• 第二种为RNA-DNA 模 型其主要特征是在转 录过程中, RNA 引导链 与靶标的一条DNA 形 成二聚体, 从而导致沉 默。
Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基
（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则 Score值越大。
E value:随机匹配的可能性
Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比
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DNA序列的开放阅读框查找
预测其编码蛋白质的氨基酸序列 https:///orffinder/