产前诊断中心 PPT课件
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南京鼓楼医院
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CVS方法—经腹取样
双针活检系统由1根长15cm、外径1.2mm 的18号引导套针，及1根长20cm、外径 0.8mm的22号活检针组成。 在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子 宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯， 然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛 组织,连接含2-4ml生理盐水的20ml注射器， 以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组 织
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脐带血细胞培养
量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴） 其他同外周血
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Thanks!
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羊水细胞培养中存在的问题 ——细胞不生长、不贴壁
最常见的原因是支原体污染 培养基PH不适当，偏酸（＜6.4或偏碱＞ 7.4均不利 最合适的穿刺时间16-20周
产前诊断中心
南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题 ——细胞及染色体收获少
每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透 明透亮的圆形细胞） 滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别 操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消 化的时间 羊水中胎脂多时3-5天可轻轻动一动，减少 胎脂贴壁占据空间 低渗时间短于外周血（一般3-5分钟）
产前诊断中心
南京鼓楼医院
产前诊断的方法
胎儿组织取样（皮肤、肝脏） 胎儿镜（fetoscope） 胚胎镜（embryoscope） 胎儿超声波图象（fetal ultrasound imaging） 母体外周血胎儿细胞检测（cell-storing）
产前诊断中心
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绒毛穿刺取样—历史
穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部 超声波定位引 导 采用22号或21号带芯长腰穿刺针头 垂直、快速进针 抽取羊水2ml弃置，换空针抽取羊水
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羊膜腔穿刺—并发症
胎儿丢失 羊膜腔感染 羊水渗漏 穿刺部位的出血、血肿
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羊穿并发症---胎儿丢失
1976年，Nihd Registry 报道流产率3.5% 1986年，Tabor et al 报道流产率1.7% 1995年，Bombard et al 报道流产率1.3% 2000年, Antsaklis 报道流产率2.1%
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产前诊断中心
脐带穿刺部位
产前诊断中心
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脐血穿刺—确定胎儿血样
血红蛋白电泳 Kleihauer-Betke试验：胎儿红细胞在酸中稳 定 APT试验：NaOH中胎儿血为粉红色 有核红细胞的出现
产前诊断中心
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脐血穿刺—排除脐血中母血污染
X染色体DMD基因内部5对CA重复
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产前诊断中心
脐带血穿刺—并发症
穿刺部位的出血 脐带血肿 短暂性胎心减慢 宫内感染 胎儿丢失（流产、早产） 大多数并发症为短暂性和非致命性
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脐带血穿刺并发症—胎儿丢失
Maxwell 1991年报道胎儿超声结构筛查示 正常超声者脐穿的流产率为1%（1/76）； 异常超声者流产率为7%（5/76）；胎儿结 构明显异常者流产率为25%（9/36） Antsaklis 1998年报道胎儿超声结构筛查示 正常超声者脐穿的流产率1%（2/191）； 异常超声者流产率为13%（11/84）
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脐带血穿刺—时间
16周—分娩（最佳24—28周）
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脐带血穿刺—取血量
3—5ml 20周后抽取6—8ml对胎儿循环无不良影响
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脐带血穿刺—适应症
胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的 FGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培 养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X综合 症等） 胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等） 胎儿感染（弓形虫、病毒感染等） 胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等） 遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、 代谢性疾病等） 胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）
1975年 我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问 世（经宫颈盲吸法，准确率95%，自然流 产率9.3%，出生婴儿未发现异常） 莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸 样） 1983您 Ward 和 Brambati 分别于英国和意 大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析
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绒毛穿刺取样—时间
产前诊断中心
南京鼓楼医院
脐带血穿刺—历史
1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠 孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血 标本。 1979年，Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐 带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到 限制。 1983年，Ternand Daffos超声引导下经皮 脐血管穿刺取血（Cordocentesis）
细菌 真菌 支原体 病毒 其他细胞
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产前诊断中心
羊水细胞培养中存在的问题 ——母体细胞污染
若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎 儿诊断为嵌合体 母体细胞在培养中占优势
产前诊断中心
南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题 ——母体细胞污染的预防
羊水穿刺时，把最先抽得的1-2ml羊水弃掉 染色体多态现象的测试 羊水细胞、母体细胞 的HLA组织定型鉴别
产前诊断中绒毛、脐血、 羊水取样及标本培养
南京大学附属鼓楼医院妇产科 产前诊断中心 李 洁 副主任医生 2006年11月
产前诊断指征
夫妇任一方有染色体异常； 曾生育过染色体病患者； 夫妇任一方为单基因病患者； 曾生育过单基因病患者； 有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产 或新生儿死亡史；
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绒毛组织的染色体检查—直接法
绒毛组织的分离洗脱 加秋水仙素（终浓度2ug/ml，可一次加，也可分 次少量加） 37OC 5%CO2培养箱培养45分钟 低渗（1%枸橼酸钠低渗10分钟或1%枸橼酸钠和 0.075mol/l 1：1低渗40分钟） 预固定（甲醇：冰醋酸 3：1）10分钟 固定（甲醇：冰醋酸 3：1）10-20分钟 冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打） 制片
CVS的流产率不比amniocentesis高 经宫颈和经腹取样安全性相同 （Jackson,1992） 多胎取样高于单胎取样（Pergament,1992）
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CVS并发症－LRD
1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS 与LRD无关（216，381例CVS中115例出现 LRD发生率1：1881，总的人群发生率1： 1642） 世界各地相关资料综合，9周以下CVS出现 LRD的机会高，但原因尚不清楚 CVS不应在小于孕10周的条件下进行
妊娠9—11周
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绒毛穿刺取样—抽取量
20mg左右
（染色体核型分 析约需10mg，DNA分析约需 5mg，生化测定约需5-10mg）
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绒毛穿刺取样—并发症
胎儿丢失 胎儿肢体发育缺陷（LRD）
产前诊断中心
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CVS并发症—胎儿丢失
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产前诊断中心
绒毛穿刺取样—方法
经宫颈（transcervical） 经腹（transabdorminal）
产前诊断中心
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CVS方法—经宫颈取样
B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实 时超声诊断仪，经腹探头频率 3.5MHz,经阴道探头频率5 - 7MHz。 采用特制较细的滋养层活检导管 （多聚乙烯导管），其塑料导管外 径1.4 – 1.6 mm,长20cm,带有导管 芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探 子。 导管另一端连接10-20ml含有2-4ml 生理盐水的注射器
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产前诊断中心
羊水细胞培养—细胞类型
成纤维样细胞（F细胞） 上皮样细胞（密集型上皮样细胞-E细胞、镰 刀样上皮细胞、圆形上皮细胞） 羊水样细胞（AF细胞）
产前诊断中心
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羊水细胞培养—收获方法
原位法 消化法 刮取法
产前诊断中心
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羊水细胞培养中存在的问题 ——污染
产前诊断中心
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产前诊断指征
羊水过多的孕妇； 夫妇任一方曾接触致畸因素； 孕妇年龄大于35岁； 有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。 产前筛查高风险的孕妇 超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇
产前诊断中心
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产前诊断的方法
羊膜腔穿刺取样（amniocentesis） 绒毛穿刺取样（chorion villus sampling,cvs） 脐带血取样（periumbilical cord blood sampling,PUBS） 植入前诊断（preimplantaton genetic diagnosis,PGD）
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羊膜腔穿刺—时间
16—20周
产前诊断中心
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Байду номын сангаас
羊膜腔穿刺—抽取量
20—30ml
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抽取的羊水用途
核型分析——诊断染色体病 DNA分析——诊断单基因病 生化测定——诊断NTD、代谢性疾病
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羊水穿刺
产前诊断中心
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CVS注意事项
动作要轻柔 穿刺部位在胎盘绒毛叶 抽吸次数不宜过多
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羊膜腔穿刺—历史
1956年 Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别 鉴定及胎儿Rh溶血诊断 1966年 Mark steele和Roy Breg从羊水中分 离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析
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产前诊断中心
绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法
绒毛挑选洗脱 绒毛组织剪成小块入培养瓶（25ml培养瓶 每瓶10mg） 加特定培养液3ml 培养3-6天 收获（加秋素、低渗、固定、制片）
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绒毛组织的染色体检查—贴壁培养法
绒毛组织挑选洗脱 绒毛组织剪成小块 加0.25%+0.02%EDTA 5ml 37OC 摇床中20 分钟 加培养基终止消化，离心后弃上清加培养 基接种培养5-10天 收获
序列的连锁分析
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绒毛组织、羊水细胞、 脐血细胞培养
绒毛组织的培养
直接法 培养法（悬浮培养、贴壁培养）
产前诊断中心
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绒毛组织的染色体检查—直接法
孕早期Langhan’s细胞有较高的有丝分裂活 性，能提供足以分析的良好有丝分裂相， 较绒毛培养简易可靠、操作简单快速
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CVS方法—经腹取样
双针活检系统由1根长15cm、外径1.2mm 的18号引导套针，及1根长20cm、外径 0.8mm的22号活检针组成。 在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子 宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯， 然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛 组织,连接含2-4ml生理盐水的20ml注射器， 以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组 织
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脐带血细胞培养
量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴） 其他同外周血
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Thanks!
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羊水细胞培养中存在的问题 ——细胞不生长、不贴壁
最常见的原因是支原体污染 培养基PH不适当，偏酸（＜6.4或偏碱＞ 7.4均不利 最合适的穿刺时间16-20周
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羊水细胞培养中存在的问题 ——细胞及染色体收获少
每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透 明透亮的圆形细胞） 滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别 操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消 化的时间 羊水中胎脂多时3-5天可轻轻动一动，减少 胎脂贴壁占据空间 低渗时间短于外周血（一般3-5分钟）
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产前诊断的方法
胎儿组织取样（皮肤、肝脏） 胎儿镜（fetoscope） 胚胎镜（embryoscope） 胎儿超声波图象（fetal ultrasound imaging） 母体外周血胎儿细胞检测（cell-storing）
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绒毛穿刺取样—历史
穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部 超声波定位引 导 采用22号或21号带芯长腰穿刺针头 垂直、快速进针 抽取羊水2ml弃置，换空针抽取羊水
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羊膜腔穿刺—并发症
胎儿丢失 羊膜腔感染 羊水渗漏 穿刺部位的出血、血肿
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羊穿并发症---胎儿丢失
1976年，Nihd Registry 报道流产率3.5% 1986年，Tabor et al 报道流产率1.7% 1995年，Bombard et al 报道流产率1.3% 2000年, Antsaklis 报道流产率2.1%
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脐带穿刺部位
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脐血穿刺—确定胎儿血样
血红蛋白电泳 Kleihauer-Betke试验：胎儿红细胞在酸中稳 定 APT试验：NaOH中胎儿血为粉红色 有核红细胞的出现
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脐血穿刺—排除脐血中母血污染
X染色体DMD基因内部5对CA重复
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脐带血穿刺—并发症
穿刺部位的出血 脐带血肿 短暂性胎心减慢 宫内感染 胎儿丢失（流产、早产） 大多数并发症为短暂性和非致命性
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脐带血穿刺并发症—胎儿丢失
Maxwell 1991年报道胎儿超声结构筛查示 正常超声者脐穿的流产率为1%（1/76）； 异常超声者流产率为7%（5/76）；胎儿结 构明显异常者流产率为25%（9/36） Antsaklis 1998年报道胎儿超声结构筛查示 正常超声者脐穿的流产率1%（2/191）； 异常超声者流产率为13%（11/84）
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脐带血穿刺—时间
16周—分娩（最佳24—28周）
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脐带血穿刺—取血量
3—5ml 20周后抽取6—8ml对胎儿循环无不良影响
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脐带血穿刺—适应症
胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的 FGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培 养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X综合 症等） 胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等） 胎儿感染（弓形虫、病毒感染等） 胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等） 遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、 代谢性疾病等） 胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）
1975年 我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问 世（经宫颈盲吸法，准确率95%，自然流 产率9.3%，出生婴儿未发现异常） 莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸 样） 1983您 Ward 和 Brambati 分别于英国和意 大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析
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绒毛穿刺取样—时间
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脐带血穿刺—历史
1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠 孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血 标本。 1979年，Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐 带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到 限制。 1983年，Ternand Daffos超声引导下经皮 脐血管穿刺取血（Cordocentesis）
细菌 真菌 支原体 病毒 其他细胞
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羊水细胞培养中存在的问题 ——母体细胞污染
若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎 儿诊断为嵌合体 母体细胞在培养中占优势
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羊水细胞培养中存在的问题 ——母体细胞污染的预防
羊水穿刺时，把最先抽得的1-2ml羊水弃掉 染色体多态现象的测试 羊水细胞、母体细胞 的HLA组织定型鉴别
产前诊断中绒毛、脐血、 羊水取样及标本培养
南京大学附属鼓楼医院妇产科 产前诊断中心 李 洁 副主任医生 2006年11月
产前诊断指征
夫妇任一方有染色体异常； 曾生育过染色体病患者； 夫妇任一方为单基因病患者； 曾生育过单基因病患者； 有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产 或新生儿死亡史；
产前诊断中心
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绒毛组织的染色体检查—直接法
绒毛组织的分离洗脱 加秋水仙素（终浓度2ug/ml，可一次加，也可分 次少量加） 37OC 5%CO2培养箱培养45分钟 低渗（1%枸橼酸钠低渗10分钟或1%枸橼酸钠和 0.075mol/l 1：1低渗40分钟） 预固定（甲醇：冰醋酸 3：1）10分钟 固定（甲醇：冰醋酸 3：1）10-20分钟 冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打） 制片
CVS的流产率不比amniocentesis高 经宫颈和经腹取样安全性相同 （Jackson,1992） 多胎取样高于单胎取样（Pergament,1992）
产前诊断中心
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CVS并发症－LRD
1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS 与LRD无关（216，381例CVS中115例出现 LRD发生率1：1881，总的人群发生率1： 1642） 世界各地相关资料综合，9周以下CVS出现 LRD的机会高，但原因尚不清楚 CVS不应在小于孕10周的条件下进行
妊娠9—11周
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绒毛穿刺取样—抽取量
20mg左右
（染色体核型分 析约需10mg，DNA分析约需 5mg，生化测定约需5-10mg）
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绒毛穿刺取样—并发症
胎儿丢失 胎儿肢体发育缺陷（LRD）
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CVS并发症—胎儿丢失
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绒毛穿刺取样—方法
经宫颈（transcervical） 经腹（transabdorminal）
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CVS方法—经宫颈取样
B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实 时超声诊断仪，经腹探头频率 3.5MHz,经阴道探头频率5 - 7MHz。 采用特制较细的滋养层活检导管 （多聚乙烯导管），其塑料导管外 径1.4 – 1.6 mm,长20cm,带有导管 芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探 子。 导管另一端连接10-20ml含有2-4ml 生理盐水的注射器
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羊水细胞培养—细胞类型
成纤维样细胞（F细胞） 上皮样细胞（密集型上皮样细胞-E细胞、镰 刀样上皮细胞、圆形上皮细胞） 羊水样细胞（AF细胞）
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羊水细胞培养—收获方法
原位法 消化法 刮取法
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羊水细胞培养中存在的问题 ——污染
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产前诊断指征
羊水过多的孕妇； 夫妇任一方曾接触致畸因素； 孕妇年龄大于35岁； 有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。 产前筛查高风险的孕妇 超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇
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产前诊断的方法
羊膜腔穿刺取样（amniocentesis） 绒毛穿刺取样（chorion villus sampling,cvs） 脐带血取样（periumbilical cord blood sampling,PUBS） 植入前诊断（preimplantaton genetic diagnosis,PGD）
产前诊断中心
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羊膜腔穿刺—时间
16—20周
产前诊断中心
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Байду номын сангаас
羊膜腔穿刺—抽取量
20—30ml
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抽取的羊水用途
核型分析——诊断染色体病 DNA分析——诊断单基因病 生化测定——诊断NTD、代谢性疾病
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羊水穿刺
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CVS注意事项
动作要轻柔 穿刺部位在胎盘绒毛叶 抽吸次数不宜过多
产前诊断中心
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羊膜腔穿刺—历史
1956年 Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别 鉴定及胎儿Rh溶血诊断 1966年 Mark steele和Roy Breg从羊水中分 离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析
南京鼓楼医院
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绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法
绒毛挑选洗脱 绒毛组织剪成小块入培养瓶（25ml培养瓶 每瓶10mg） 加特定培养液3ml 培养3-6天 收获（加秋素、低渗、固定、制片）
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绒毛组织的染色体检查—贴壁培养法
绒毛组织挑选洗脱 绒毛组织剪成小块 加0.25%+0.02%EDTA 5ml 37OC 摇床中20 分钟 加培养基终止消化，离心后弃上清加培养 基接种培养5-10天 收获
序列的连锁分析
产前诊断中心
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绒毛组织、羊水细胞、 脐血细胞培养
绒毛组织的培养
直接法 培养法（悬浮培养、贴壁培养）
产前诊断中心
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绒毛组织的染色体检查—直接法
孕早期Langhan’s细胞有较高的有丝分裂活 性，能提供足以分析的良好有丝分裂相， 较绒毛培养简易可靠、操作简单快速