分析real-time PCR数据
Real time PCR 从原理到实验方法及数据分析
循环数
为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。
设n=CT，则：
RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) – lg Rs
基线 阈值 Ct值 [DNA]0
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
线性图谱
扩增曲线：四个阶段
平台期
线性增长期 指数增长期 基线期
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
对数图谱
基线 阈值 Ct值
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分。
[DNA]0
T=24hr
IL-2 18S ΔCt 24 9 15 24 10 14 23 11 12
28 10 18
ΔΔCt 0 -1 -3
3
2-ΔΔCt 1.0 2.0 8.0
0.1
Relative Quantity of Expression
10
8.0
8
6
4
2.0
2
1
0.1
0
t=0 t=1h t=6h t = 24 h
TaqMan 探针
R
Q
5’3’下游引物RQ5’
3’
1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针
RealtimePCR原理及其定量方法
定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应中每一 个循环产物荧光信号的实 时检测从而实现对起始模 板定量及定性的分析
2、荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线、阈值、CT值
plateau phase Liner phase
Exponential phase
Normalised reporter Fluorescence （Rn)
另一种思路
由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成 正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑 荧光本底值，则：
Rn= RB+ X0(1+ Ex) Rs
总荧光信号强度=本底信号+分子数量×单位信号强度
Rn：第n个循环时的总信号 RB：本底 RS：单位信号强度 X0：起始DNA数目 Ex：PCR扩增效率
线性关系、扩增效率确认
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 到 -3.5 PCR扩增效率（Ex）: 0.9到1.2
扩增效率
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
扩增效率理论值为1，即每增加一个循环PCR产物加倍。
实时荧光定量PCR原理和定量方法 一、荧光定量PCR的原理
在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号累积 实现了实时监测整个PCR进程， 对起始模板进行定量分析的 方法。
三个关键词： 实时，定量，荧光
1、定量与常规PCR的差别
常规PCR技术： 对 PCR 扩 增 反 应 的 终产物进行定量及 定性分析
非理想的PCR反应：
Xn＝X0 ×（1＋Ex）n
n：扩增循环数 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量 Ex：PCR扩增效率
real time PCR 数据分析
real time PCR 数据分析real-timepcr数据分析无论所使用的real-timepcr是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。
这里介绍有关real-timepcr数据分析的知识。
在探讨基本分析过程之前，先了解如何设计一个不好的实验。
如果你就是自己设计的引物和探针，那有利于下一步的工作。
但是在有些情况下，人们采用出版发行文献上的序列可以更便利。
忘记，即便就是出版物提供更多的序列也无法确保可以获得优化的实验结果。
而且排印错误的可能性也须要考量在内。
所以步入实验室之前采用blast对全部序列展开核实保证他们就是恰当的。
下订单前先检察引物和探针的序列和tm值就是实验设计的基本建议。
标准曲线是判断实验质量的重要手段。
使用一个已知的模板，pcr产物，合成的寡核苷酸或转录的rna做个标准曲线能够确定pcr的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。
建立标准曲线时使用od260的模板样本。
模板的总量以dna分子的数量来描述，把质量转化为dna含量的公式如下：（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均值质量*模板的长度。
例如，合成70-mer的单链dna，样本质量为0.8*10?-11gm。
代入公式得：（0.8*10?-11*6.023*10?23molecules/mole）330gm/mole/base*70base。
如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。
标准曲线采用的模板含量从1*10?7已经开始已连续吸收7次每次吸收10倍，最终获得10个模板拷贝。
这样的浓度有利于获得最低的δrn和最高的ct。
用excel画曲线时以模板数量的对数值为x，ct（cyclethreshold）值y轴。
标准曲线的计算公式如下：y=mx+b。
y就是ct，m是斜率，x=log10templateamount，b=y-intercept。
用斜率排序出来实验效率efficiency【10?（-1/斜率）】-1。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
实时定量PCR技术(real-time PCR)
样品重复
重复次数请遵循统计学的要求 小样本统计，n>6（n>3） 未知样品和标准品都要重复 所有复管在同样条件下完成PCR
2.2 技术方法及数据
绝对定量与相对定量
绝对定量：绝对标准曲线法
标准品拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释 倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓 度/样本分子量×6×1014
扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为： 扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指 数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产 物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2， 就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32， 斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%， 表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
TaqMan探针
TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸 收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可 以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振 能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放 的荧光被屏蔽。
PCR效率对定量结果的影响
Real-timePCR实验原理与技术
实时荧光定量PCR技术原理
01
在实时荧光定量PCR反应中， DNA模板被扩增时，与荧光探 针结合，产生荧光信号。
02
随着DNA的扩增，荧光信号逐 渐增强，通过对荧光信号的实 时监测和分析，可以计算出 DNA的起始浓度。
03
通过标准曲线或内参基因的校 准，可以将起始浓度转化为目 标基因的表达量或基因拷贝数 。
实时监测荧光信号
实时监测荧光信号，确保PCR产物在指数扩增阶段被检测到。
标准化实验流程
建立标准化实验流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
未来展望
新技术应用
01
随着新技术的不断发展，如数字PCR、微流控PCR等，Real-
time PCR技术将得到进一步优化。
高通量检测
02
通过多重PCR和高通量检测平台，实现大规模样本的快速检测。
03
Real-time PCR 实验数 据分析
数据收集与整理
数据收集
在实时PCR实验中，数据收集通常涉 及记录每个循环的荧光信号强度。这 些数据通常以图表形式表示，其中横 轴表示循环数，纵轴表示荧光信号强 度。
数据整理
收集到的原始数据需要经过整理，包 括去噪、去除异常值和标准化等步骤， 以确保数据分析的准确性。
自动化与智能化
03
实现Real-time PCR的自动化和智能化，提高实验效率，减少人
为误差。
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real-timepcr实验原 理与技术
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目录
• Real-time PCR 实验原理 • Real-time PCR 实验技术 • Real-time PCR 实验数据分析 • Real-time PCR 实验应用 • Real-time PCR 实验注意事项与优化建
pcr数据分析
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。
最好能在冰上操作。
一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。
rt-pcr结果判读标准
实时定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种用于检测和定量RNA表达水平的高灵敏度技术。
RT-qPCR结果的判读通常遵循以下标准：1. 阈值循环（Threshold Cycle，Ct值）：- Ct值是指达到检测阈值时的循环次数，它反映了样本中目标RNA的初始浓度。
- Ct值越低，表示目标RNA的浓度越高。
-通常，Ct值低于某个特定值（如30或35）被认为是阳性结果，高于这个值则认为是阴性结果。
2. 相对表达量：-相对表达量是通过比较不同样本的Ct值来计算的，通常使用2^(-ΔCt)的方法，其中ΔCt是目标基因与内参基因Ct值之差。
-相对表达量大于1表示目标基因的表达量高于参照样本，小于1则表示表达量低于参照样本。
3. 标准曲线和溶解曲线：-标准曲线是通过一系列已知浓度的标准品来建立的，用于校正实验中的技术变异，并确保目标RNA的准确定量。
-溶解曲线用于评估扩增产物的一致性和特异性，通常在扩增结束后进行。
4. 内参基因：-内参基因是用于校正样本间RNA提取效率差异的基因，其表达量通常不受实验条件影响。
-选择合适的内参基因对于正确解读RT-qPCR结果至关重要。
5. 数据分析：-数据分析时，应考虑实验的重复性、样本间的变异性和统计学显著性。
-应使用适当的统计测试来确定结果是否具有统计学意义。
6. 质量控制：-质量控制包括检查RNA的完整性、纯度和浓度，以及PCR扩增的效率和特异性。
-应使用阴性对照和阳性对照来验证实验的准确性和可靠性。
在判读RT-qPCR结果时，应综合考虑上述标准，并结合实验的具体情况和目的进行综合分析。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
谈谈如何分析RealtimePCR的结果
谈谈如何分析RealtimePCR的结果一直瞎白话，作为一名知识分子，好歹也得干点儿正经事，既然做科研，就得严谨，就得实事求是。
言归正传，写点儿如何分析Realtime PCR结果的体会。
为什么想这个呢？我们实验室现在做这个的越来越多，但是看到他们做Presentation时的结果分析的统计图就知道，他们没踏实搞清楚如何去分析结果，就上去糊弄老板了，我曾严肃的当场指出过，但是师姐气得直瞪眼，丫就不明白我是真为她好，我也就懒得跟她纠缠了。
但是作为当代，我国，世界级著名学府（校领导自称的），一流专业（就是没什么人报名，一半是调剂的），牛B 教授（这个是实话）的不用心学生，我还是忍不住要说一说。
关于Realtime PCR的所有情况的结果如何分析，我不都懂，也不想都懂，但是我需要的关于基因表达差异的2-ΔΔCt分析方法，这一点我还是比较清楚的。
原理：其实就是这个公式：X n=X o× (1+E x)nX n，表示n个循环后的分子数;X o，表示初始模板分子数;E x，表示分子扩增效率;n，表示循环数。
首先我们要明白，Realtime PCR的终极目的是要检测其初始模板的量的相对或绝对量（这就是半定量或定量Realtime PCR的区别）。
还有一个最为重要的概念就是Ct值，是指目标扩增产物达到所设定的阈值时所经历循环数。
再回到刚才的公式中，我们可以得到下面的式子：X t = X o× (1+E x)Ctx = K x （1）X t，表示到达阈值时的分子数;K x，是个常数，因为这是人为设定的。
其他同前式。
那么，同理，内参也有一个这样的式子：R t = R o× (1+E x)CtR = K R （2）把结果均一化，所谓均一化就是通过内参的比较，去除加入模板时的人为差异，即（1）除以（2）得出，X t / R t = X o / R o × (1+E x)CtX- CtR = K x / K R进一步推出我们关注的初始模板均一化值：X o / R o = K x / K R × (1+E x)-（CtX - CtR），令CtX - CtR =ΔCt，因此，可得X o / R o = K x / K R × (1+E x)ΔCt（3）至此，我们得到了组内的模板的均一化相对或绝对值，下一步是组间的差异比较。
Real-time PCR数据分析
由于Real-time qPCR 的众多优点，现在已是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR 的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，不少没有做过real-time qPCR 的研究者往往感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从real-time qPCR 的发展史说起，包括real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR 发展史Real-time qPCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开辟，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的作用。
1995 年，美国PE 公司(已经并入Invitrogen 公司)成功研制了Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每一个循环的荧光强度，通过Ct 值进行数据分析。
从而荧光定量PCR 获得广泛应用。
现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@ 系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER 的LineGene 系列。
分析realtimePCR数据
用2-△△Ct法分析real-time PCR数据-----联合应用LightCycler Data Analysis软件和MS ExcelBy netmee，netmee163.引用请注明作者。
1、打开存取的数据文件，点击2、依次点击，，这是适合SYBR green为染料的选项。
点击step1：Baseline下的“change graph settings”小图标。
取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项，点击“OK”按钮，退出选项卡。
3、点击下的“change graph settings”小图标，取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项，点击“OK”按钮，退出选项卡。
4、在选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。
5、可以在选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。
观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。
6、如果确为直线，则左侧的“Crossing Point”值为所需要的Ct值。
7、依次选取下图菜单：将数据导出为文本文件。
8、打开所保存的文本文件，如图选取9、将数据粘贴入新建的excel文件，“Crossing Point”列即是Ct值，删除“Standard”和“Calculated Concentration”列。
10、将目的基因，本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入beta-actin值右侧一列。
分别标记两列数据为“beta-actin”和“iNOS”。
11、设置所有Ct值的单元格格式12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。
13、将E列（目的基因Ct值右侧一列）输入公式“=D4-C4”，求出目的基因与同管beta-actin Ct值之差，即△Ct。
14、向下拉复制公式，将△Ct列数值计算出。
15、在△Ct 列右侧一列插入公式“=POWER(2,(0-E4))”，此即目的基因相对beta-actin的相对表达量，即2-△Ct（2的-△Ct次方）。
实时荧光定量PCR原理与分析方法Real-time,fluorescence
匠心品质，快乐科研 Good Science，G ood Products实时荧光定量PCR原理与分析方法Real-time, fluorescence-based quantitative PCR 孟文举上海翊圣生物科技有限公司产品主管2018.09通过这场讲座，您可以了解：问题1：深入理解qPCR原理问题2：正确的结果解读问题3：提升qPCR实验结果可信度的几点建议问题4： qPCR的解题思路内容概要荧光定量PCR 概述实验安排常见问题123难点解答4内容概要荧光定量PCR 概述实验安排常见问题123难点解答4SNP鉴定病毒检测拷贝数检测表达量检测测序数据验证微生物诊断分子诊断基础研究动物疫病食品安全Main advantage:the starting DNA concentration •in a closed-tube systemqPCR 能够解决什么问题DNA intercalating moleculesfluorescent reporter moleculesfluorophore-labeled oligonucleotides•binds to the minor groove of dsDNA •non-specific•extension phase of each cycle of qPCR •hydrolysis probe•specific PCR products •extension phaseqPCR 的检测基础：chemistryDNA intercalating moleculesfluorophore-labeledoligonucleotides (Taqman) Structure Intercalating dye5´R---Q3´Advantages•Lower costs•melting curve analysis •Specific•more sensitive andreproducible(Lowly-expressed gene)Disadvantages•non-specific•Expensive•primer-dimers might be formedApplications pathogen detection, gene expression,mutation detection, SNP detection virus detection , viral/bacterial load quantitation, genotyping, allelic discrimination, mutation detection, SNP detection, gene expression analysisSYBR Green ⅠVS TaqMan ProbeClin Chim Acta. 2015 Jan 15;439:231-50.qPCR的检测基础：指数扩增Determining Starting template concentrationqPCR VS PCR: qualitative or quantitativeA≈BA ＞B ，且A=3BA BqPCR ABPCR•showing the presence or absence of the DNA sequence of interest •quantitativeqPCR 的检测基础：指数扩增qPCR的检测基础：指数扩增Determining Starting template concentration✔✘内容概要荧光定量PCR 概述实验安排常见问题123难点解答4内容概要荧光定量PCR 概述实验安排常见问题123难点解答4qPCR的实验安排n知其然，知其所以然（实验结果）1/：表达量差异的可信度n做好准备，万无一失（实验准备）1/：模板制备与保存2/：反转录实验的安排3/：qPCR实验的安排Seven Key Steps一、实验结果主要呈现形式：3大曲线直接呈现形式：Ct Value and ΔΔ Ct☑溶解曲线无异常☑标准曲线无异常☑扩增曲线无异常n扩增曲线线型标准n CT值要求1.20-30个Cycle2.重复性：复孔差0.5循环以内n NTC和NRC无扩增n溶解曲线线型标准n NTC和NRC无溶解曲线n斜率n扩增效率：90-110%n R2n NTC和NRC无值qPCR的实验结果：可信度分析——Ct value and ΔΔ CtCt Value 的可信度：扩增曲线无异常——软件的设置（基线设置和阈值设置）Ct 值阈值线基线阈值线和基线是仪器读出来的CT值准确的保证。
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用2-△△Ct法分析real-time PCR数据-----联合应用LightCycler Data Analysis软件和MS Excel
By netmee，**************
引用请注明作者。
1、打开存取的数据文件，点击
2、依次点击，，这是适合SYBR green为染料的选项。
点击step1：Baseline下的“change graph settings”小图标。
取消弹出的Customize Graph
选项卡中的Logarithmis选项，点击“OK”按钮，退出选项卡。
3、点击下的“change graph settings”小图标
，取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项
，点击“OK”按钮，退出选项卡。
4、在选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。
5、可以在选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。
观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。
6、如果确为直线，则左侧的“Crossing Point”值为所需要的Ct值。
7、依次选取下图菜单：将数据导出为文本文件。
8、打开所保存的文本文件，如图选取
9、将数据粘贴入新建的excel文件，“Crossing Point”列即是Ct值，删除“Standard”和“Calculated Concentration”列。
10、将目的基因，本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入beta-actin值右侧一列。
分别标记两列数据为“beta-actin”和“iNOS”。
11、设置所有Ct值的单元格格式
12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。
13、将E列（目的基因Ct值右侧一列）输入公式“=D4-C4”，求出目的基因与同管beta-actin Ct值之差，即△Ct。
14、向下拉复制公式，将△Ct列数值计算出。
15、在△Ct列右侧一列插入公式“=POWER(2,(0-E4))”，此即目的基因相对beta-actin的相对表达量，即2-△Ct（2的-△Ct次方）。
16、在2-△Ct列右侧插入公式“=F4/$F$4”，此列即“2-△△Ct”列，复制公式填满所有标本对应的2-△△Ct空格。
17、至此，2-△△Ct法计算的各标本目的基因的相对表达量完成，2-△△Ct列的数据可以用统计软件进行分析。