草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究_随志刚

(药理药化(收稿日期:2008-10-09; 修订日期:2008-12-20基金项目:国家自然科学基金(N o .30873360);吉林省科技发展计划资助课题(No .20080105)作者简介:随志刚(1979-),男(汉族),吉林长春人,现为吉林大学药学院在读博士研究生,硕士学位,主要从事质谱分析化学研究工作.*通讯作者简介:刘忠英(1964-),女(汉族),吉林白城人,现任吉林大学药学院教授,博士生导师,博士学位,主要从事生物化学分析研究工作.草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究随志刚1,陈明玉1,刘志强2,皮子凤2,刘忠英1*(1.吉林大学药学院,吉林长春 130021; 2.中国科学院长春应用化学研究所,吉林长春 130022)摘要:目的优化草乌中乌头类生物碱提取方法,比较草乌、附子生品及市售炮制品中乌头类生物碱的含量,为相关中药中生物碱的测定和临床应用提供参考。

方法分别用7种提取方法提取附子中乌头类生物碱,比较各方法对3种双酯型生物碱的提取效率,并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量。

结果10%氨水乙醚冷浸法对3种双酯型生物碱的提取效率最高。

炮制品中的乌头类生物碱含量明显低于生药,各种炮制品中乌头类生物碱的含量差别也比较大。

结论采用10%氨水乙醚冷浸法,高效液相色谱-紫外光谱(H PLC-UV )法对药材中乌头类生物碱进行提取和含量测定,能真实反映药材中药效和毒性成分。

不同的炮制品中各生物碱含量差别较大,临床应用应有差别。

关键词:提取方法; 草乌; 附子; 乌头碱类生物碱中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2009)03-0513-02Co mparison of D ifferent Extraction M ethods of Aconitu m A lkaloids fro m Radix Aconiti Kus nezoff iiS U I Z h-i gang 1,C H EN Ming -yu 1,L I U Z h-i q iang 2,P I Z -i feng 2,L I U Z hong -y i n g1*(1.College of Phar m acology,J ilin Un i v ersit y ,Changchun 130021,China;2.Changchun Institute of App lied Che m istry ,Chinese Acade m y of Sciences ,Changchun 130022,China )Abst ract :O bjective T o optim ize the ex tracti on techno logy of acon itu m a l ka l o i ds from R adi x A con iti K usnezoff ii ,and to de ter -m i ne the contents o f acon it u m a l kalo i ds i n R ad i x A conitiK usnezoffii ,Fuzi and their processed produc ts so l d i n Ch i nese phar m acy .M ethods The effi c iency of seven ex tracti on m ethods w ere compared by deter m i n i ng the conten ts o f acon i tine ,m esacon iti ne and hypacon iti ne of sa m ples extracted by d ifferent m ethods .The H PLC -UV m ethod w as used to deter m i ne t he contents o f acon itu m a l ka l o i ds i n R ad i x A conitiK usnezoffii ,Fuzi and their processed products .Re s u lts The m ost e fficient me t hod was to ex tract sa m ple w it h e t her from the herb sub m erged i n 10%a mm onia .T he three diester-d iterpeno i d a l ka l o i ds o f processed products w ere m uch lo w er than t hose o f the raw herbs and the con tents o f acon it u m a l kalo i ds i n d iffe rent processed products we re different w i de l y .Conc l u sion The me t hods used i n ex tracti on and ana l ysis f o r acon itu m a l ka l o i ds from herbs are e ffecti v e ,reli able and si m ple .D i -f ferent k i nds o f processed products of ra w herbs shou l d be d i scri m i nati ng l y treated in cli nic applica ti on .K ey w ords :Ex tracti on m ethod ; R ad i x A coniti Kusnezoff ii ; Fuz;i A conitu m a l kalo i ds 在乌头类生药及炮制品中,生物碱成分既是药效成分同时也是毒性成分[1],而且稳定性不好,很容易降解[2],所以生物碱的提取方法在其成分分析中十分重要。

目前有关生物碱的提取方法有很多[3~5],但是,各种方法对双酯型生物碱的提取效率的比较研究尚无报道。

中医临床常用的乌头类中药为附子的炮制品,市售的附子炮制品饮片按不同的炮制方法分为盐附子、黑附片、白附片、淡附子、熟附片及炮附子等[6],但是,不同的炮制方法,必然会造成生物碱含量的不同,在使用上应有所区别。

本文比较了7种提取方法对乌头类中药中3种双酯型生物碱的提取效率,并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量,以期准确测定附子中生物碱,为保证此类中药的临床应用更为安全合理提供可靠的分析方法。

1 仪器与试剂1.1 仪器LC -10A 高效液相仪(Shi m adzu ,日本);超声清洗器(Autosc i ence ,天津);高速离心机(Eppendo r,f 德国);电子天平(Sarto ri us ,德国)。

1.2 试剂乌头碱,中乌头碱和次乌头碱对照品购自中国药品生物制品检定所。

生附子、生草乌购自四川江油,制草乌、黑附片、白附片、盐附子、淡附子购自吉林省长春市吉深药店,经长春中医药大学王淑敏教授鉴定均为正品。

甲醇为色谱纯,水为去离子水,乙醚、二氯甲烷等其他试剂为分析纯。

2 方法与结果2.1 方法学考查2.1.1 色谱条件A g ilent extended C 18色谱柱(150mm @4.6mm,5L m );流动相为甲醇B 0.1%三乙胺(65B 35);流速为0.6m l #m i n -1;检测波长为230nm ;柱温为30e ;样品经过0.45L m 微孔滤膜过滤,滤液进样10L l 。

2.1.2 标准曲线精密称取中乌头碱、乌头碱和次乌头碱对照品适量置于容量瓶中,加入二氯甲烷溶解并定容,得浓度为1.08m g #m l -1的中乌头碱、1.12m g #m l -1的乌头碱和1.22m g #m l -1的次乌头碱标准品储备液。

每种对照品溶液分别进样2,4,6,8,10L ,l 高效液相色谱法测定。

以浓度(L g #m l -1)对峰面积计算回归曲线。

得到中乌头碱标准曲线方程为Y =20672.0X -58377.5,r =0.9995;乌头碱标准曲线方程为Y =18114.2X -28544.2,r =0.9999;次乌头碱的标准曲线方程为Y =186632X -13386.7,r =0.9993。

说明乌头碱在5.6~112L g #m l -1、中乌头碱在5.4~108L g #m l -1,次乌头碱在6.1~122L g #m l -1的浓度范围内均呈良好的线性。

2.1.3 重复性实验同一生草乌粉末按优选的提取方法操作,提取6份溶液,H PLC 测定,记录乌头碱、中乌头碱、次乌头碱峰面积。

乌头碱、中乌头碱和次乌头碱含量的RSD 值分别为4.32%,3.57%和4.84%。

说明方法重复性较好。

2.1.4 回收率实验精密称取已知含量的生草乌粉末18份,每份0.2g 。

第1个6份分别加入0.05m g 乌头碱,第2个6份分别#513#L I SH I Z H EN M EDIC I NE AND M ATER I A M ED I CA RESEARCH 2009VOL.20NO.3时珍国医国药2009年第20卷第3期加入0.4m g中乌头碱,第3个6份分别加入0.2m g次乌头碱,同法操作计算含量,乌头碱的平均回收率为91.2%,RSD值为2.84%;中乌头碱的平均回收率为90.4%,RS D值为3.12%;次乌头碱的平均回收率为92.8%,RS D值为3.10。

表明方法回收率较好。

2.1.5稳定性实验同一生草乌粉末样品溶液保存于-80e冰箱中,于放入冰箱后第4,8,12,18,24小时测定,计算含量。

24h 内乌头碱、中乌头碱和中乌头碱含量的RSD值分别为5.21%, 4.35%和6.24%。

表明提取液在-80e冰箱中24h内较稳定。

2.2提取方法的优选2.2.1水提氯仿萃取法称生草乌2.0g于带塞锥形瓶中,加30m l蒸馏水,振荡6h后,转移至50m l离心管中,3000r# m i n-1离心20m i n,取上清液,沉淀水洗2次,合并上清液,用10%氨水调p H值为10,分别加入15,5,5m l氯仿萃取3次,合并氯仿层,蒸干。

加甲醇溶解,定容至25m l。

2.2.2酸提法称生草乌2.0g于带塞锥形瓶中,加30m l 0.04%H C,l振荡6h,转移至50m l离心管中,3000r#m in-1离心20m i n,取上清液,沉淀用0.04%HC l洗2次,合并上清液,加0.04%H C l定容至50m l。