激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1讲解
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2、“更多细节!”
1)、使用较高数值孔径 (NA) 的物镜 2)、增加“帧大小” = 每条线的像素值 + 每帧的线条数 3)、优化扫描焦距 (Z) 4)、增加动态范围
3、“更可靠!”
1)、使用多轨 2)、提供预定义配置。 3)、可同时定义和使用任何形状的多个 研究区。
Cultured cells, multiple fluorescence (Prof. WunderliAllenspach, ETH Zürich)
四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能
采集图像
主要功能
荧光信号定 性定位观察
定量测定 相关参数
位置 作用
2)分光镜
位置 作用
3)发射荧光分色镜
位置
4)检测器 作用
位置 作用
Fra Baidu bibliotek
描装置
扫描方式
光束扫描 台阶扫描
原理 优缺点
激光共聚焦显微镜的基本结构
扫描系统
(1)、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和 显微镜相连,与所接显微镜一体化设计
(2)、检测器数量 (3)、共聚焦针孔
50-300微米
(4)、扫描分辨率及灰度级
(5)、连续分光设计系统(或其它光谱分离系统)
(6)、光谱扫描功能 (7)、扫描速度及速度调节
(8)、扫描方式
XYZtλ任意组合 ①点扫描 ②线扫描 ③Xλ扫描 ④平面扫描
⑤XYλ、XZλ扫描 ⑥xyz, xyzt扫描 ⑦局部放大 扫描 ⑧光谱模式下,多通道同时扫描。
(9)、扫描旋转、光学放大(变倍)
应用软件功能(图象处理、数据分析、生物学 应用等):
①多通道叠加,三维重建,旋转,生成AVI文件, Average拍摄模式提高信噪比;②荧光强度动态分 析,动态显示,Ratio值测量(钙离子等);③ FRAP/FLIP;④线性光谱拆分,自定义染料光谱数 据库,背景扣除;⑤图像调节 亮度,对比度, Gamma;单个通道分别调节或多个通道同时调节; ⑥图像处理:旋转,裁剪,多种滤镜 (Kirsh/Laplace/Low pass/Median),添加标 尺,箭头,文字等;⑦图像分析:直方图,距离, 强度,强度断面分布;⑧VBA模块:宏功能,可以 录制,编辑,回放,实现自动操作;⑨多种视图: 1D,2D,正交视图,图片叠加等;⑩光谱分析具 有多种方式选择,支持盲法拆分,方便用户使用; ⑾具有专业的FRAP(荧光漂白),FRET(荧光能 量共振转移)软件包。
1) DNA用 Hoechst3334 2标记(蓝),
2)细胞膜用 NBD-PC染色 (绿),
3)线粒体用 Mitotracker标 记(红)
如何改善图像质量
1、“更多信号!”
1)、 通过减慢扫描速度 2)、 使用“平均”方法 3)、 增加发射滤镜的带宽 4)、 加大针孔直径; 注意:光学切片的厚度也会相应地增大。 5)、 增大激发能(激光功率); 注意:漂白效应、饱和效应和光毒效应。
A C. elegans EmbryoG at pro-nuclei meetingG
stage (before dividing into 2-cell embryo)
Differential Interference Contrast (DIC; Nomarski)
Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
Drosophila embryo, brain, 3D Projection - "extended depthoffocus“ (Prof. Reichert, Labor Neurobiologie University of Basel)
(三)光学系统(显微镜)
⑴、倒置荧光万能显微镜
⑵、显微镜上的外接接口 ⑶、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达 ⑷、荧光镜座要装有防振动装置 ⑸、装有光路转换装置 ⑹、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜 ⑺、载物台支架和附件的配置
Mitotic cells, multiple fluorescence (NCI Maryland)
二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成
激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy ,简称LSCM)是近代生 物医学图象仪器的最重要发展之一,它是在荧光显 微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光 或可见光激发荧光探针,利用计算机进行图象处理, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以 及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位 等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细 胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免 疫学和神经生物学等领域,对生物样品进行定性、 定量、定时和定位研究具有很大的优越性,成为这 些领域新一代强有力的研究工具。
1982年,BIO-RAD公司第一个推出商品 化激光扫描共聚焦显微镜;
1985年,Wijnaendts Van Resandt发 表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生 物学中应用的文章;
1987年,发展成现在通常意义上的第一 代激光扫描共聚焦显微镜。
仪器名称
生产商
BD高通量活细胞共聚焦分 析系统400系列
⑻、汞灯光线的强度可调
⑼、荧光显微镜的参数要与光路系统、计 算机控制软件系统相匹配
(10)、≥4位显微镜荧光滤色片组,置换方便, 覆盖紫外和可见光波长
荧光源
激发荧光能量图
单光子激励(左),多光子激励(右)
E1 E0 hc
E1
E
0
hc
1
2
E1 E0 2hc 2
单光子(λ1)
单光子(λ2)
美国Meridian公司的ACAS uLTIMA312为同类仪 器中档次最高、功能最全的精密仪器。 它能达到每秒 120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察,可提供实时,真 彩色的激光共聚焦原色图象。
BIO-RAD公司第七代Radiance 2100型激光扫描共 聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦 扫描显微镜
Multiphoton Fluorescence Excitation Microscopy (MPFE)
2、LSCM的工作原理
激光束
扫描器
载物台的升降
接收器
“细胞CT”
计算机
“光学切片”
LSCM
组 成 光 路 的 示 意 图
Beam path in the confocal laser scanning microscope
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra(Vnieikwo™n)C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
FluoView™ FV1000共聚焦显微镜
FV1000系统完美地 整合了两套相互独立的 扫描模块在一套系统内, 在一束激光进行实验刺 激的同时,另一束激光 实时地对样品进行扫描, 从而记录完整的动态变 化过程。
共聚焦原理示意图
(一)激光光源
(1)、激光谱线 (2)、激光器开闭和电压调节 (3)、激光强度回馈稳定电路设计 (4)、辅助设备
波长(nm)功率(mW)
激光器类型
325
10~30 氦镉(He-Cd)激光
351
300
带紫外的水冷式氩离子激光
364
>20
风冷氩离子激光(Ar-ion)
442
11
氦镉激光
457~514 25
小型氩离子激光
543
1.25
630
33
630
3
632
3.5
700~1100 2 000
1 152
1
绿氦-氖(He-Ne)激光 外谐振器半导体激光 碰撞脉冲染料激光 氦-氖激光 蓝宝石激光 氦-氖激光
(二)扫描器
扫描器
针孔光栏(pinhole) 分光镜 发射荧光分色镜 检测器
1)针孔光栏
1、LSCM的基本结构
荧光显微镜系统及样品台
激光光源
扫描器
图象存储及处理系统
控制
计算机控制系统
LSCM各部分相互关系示意图
共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较
激光扫描共聚焦显微镜 普通光学显微镜
激光光源 共轭聚焦原理和装置
场光源 干扰
计算机数字图象处理分析系统
照相
Light Microscopy
美国BD公司
BD 高通量活细胞共聚焦分 析系统800系列
美国BD公司
BD全光谱活细胞共聚焦高 速扫描系统
美国BD公司
尼康共焦显微镜
尼康(Nikon)
共焦激光扫描显微镜
徕卡仪器有限公司 Leica
OLYMPUS激光共聚焦显微 镜
OLYMPUS
OLYMPUS激光共聚焦显微 镜 NU光lI共tKrOa聚VNi集e共w系聚™统焦高显速微扫镜描型激
双光子(λ2)
荧光
荧光
单、双光子激发产生荧光过程的示意图
荧光光谱
分隔发射的荧光
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
(四)计算机系统
控制硬件的软件功能:
①控制电动显微镜; ②选择激光波长,调节激光强度; ③拍摄2-5维图像; ④选择光谱拍摄范围,分辨率,激发光 挡片位置。
生物物理教研室
陈丽娜
激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)
授课内容
一、LSCM的发展与现状 二、LSCM的成像原理及组成 三、LSCM的使用步骤 四、LSCM的基本功能 五、LSCM在生物医学领域中的应
用
一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状
1957年,Marvin Minsky提出共聚焦原 理;
1978年,Brandengoff在高数值孔径透 镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显 微镜;
激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统
硬件系统 软件系统
1)激光光源 2)计算机系统 3)共聚焦系统 4)光学探测系统 5)图像分辨率 6)扫描方式
1)、Image Analyze 2)、Ratio Analysis和 Kinetics 3)、Cell –Cell Communication and FRAP 4)、Cell List 5)、Cell Sorting 6)、Confocal Imaging
Xy观察模式的图象获得
设置染色方法
设置观察范围
显微镜和扫描的配置 设置物镜放大率 设置变焦率为1x 设置所需通道 设置最高扫描速度 设置xy观察模式 执行重复扫描
校正图象亮度 设置较低的扫描速度
重新校正图象亮度
停止重复扫描 获得图象
校正对于确定z位置观察所需复合的各部分条件
储存图象
三重荧光染色图谱:活HT细胞
(10)、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting,感兴趣区域) 实时(real time)显示
(11)、有线和帧方式的多重扫描功能
(12)、在改变扫描分辨率及扫描速度等后,无 须很复杂地对仪器参数重新设置 (13)、有记忆功能
(14)、有专用的图象数据库 (15)、系统采用模块化设计,便于整个系统 的扩展和升级换代
OLYMPUS 尼Pe康rk(inEnlimkoenr)
高通量共聚焦显徽细胞图像 分析测定系统
GE Healthcare
时间分辨激光共聚焦显微成 像系统
德国耶莱公司
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国 ZEISS
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国ZEISS
型号
Pathway415、 Pathway435 800系列
Cell culture, 3D shadow projection (calculated by "Imaris", Bitplane AG, Zürich) showing tight junctions (red) and cytoskeleton structures (green) (Prof. WunderliAllenspach, ETH Zürich)
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
(一)样品制备
1.组织切片标本 实验标本要求单层,并能很好地贴附在样品
池中。所以,组织标本无论是石蜡切片还是冰 冻切片,均为越薄越好。
2.细胞标本 细胞种类和纯度,细胞
密度和形态。
3.承载细胞的器皿 Petri皿和玻片。
(二)荧光探针的选择
标记生物样品的探针大约分为:
1)蛋白质、单糖和多糖探针; 2)细胞器探针; 3)核酸探针; 4)细胞活性探针; 5)膜和受体探针; 6)细胞膜电位和细胞内pH探针; 7)金属探针; 8)分子的特殊基团结合探针; 9)其他
(三)仪器使用步骤
(1)、选择激光器类型 (2)、选择相应的滤片 (3)、根据实验目的选择适当软件 (4)、按软件要求设置有关参数,进行 观察和分析。