20121115 细胞免疫检测技术

检测技术
6ห้องสมุดไป่ตู้ T淋巴细胞转化实验
T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和 有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使 相应淋巴细胞克隆发生增殖。



植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）， 抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选 择性地刺激T细胞增殖； 抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、 脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞 发生增殖； 美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对 T、 B细胞的增殖均有刺激作用。
检测技术
4. 免疫磁珠分离法
* 免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标 记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁 珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表 面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这 种表面标记的细胞分离出来。
磁珠 (microbead)
标记细胞上的磁珠在扫 描电镜下也几乎看不到
磁珠分离策略：
一. 阳性分选
B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc 受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体 （A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花 环实验和EAC玫瑰花环实验。
检测技术
2.流式细胞术
定义：流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的
高科学技术,• 它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细 胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞 大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内 DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间 内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分 析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、 免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激 光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分 选或分析。

用培养液调成 106细胞/ml
鸡外周血淋巴细胞增殖实验
1.加液： 2.离心： 3.计数 4. 铺板 5. 检测
CD4+T细胞 分离柱
CD4-T细胞
磁珠标记目的细胞
未标记细胞先行流出
移出磁场后收 集目的细胞
二. 阴性分选
磁珠标记非目的细胞
目的细胞先行流出
检测技术
5. 固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT
细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此 细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分 解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的 二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲 和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了 细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系 统对斑点的分析后得出结果.
检测技术
1. E玫瑰花环形成试验 erythocyte rosette test
实验原理：人和动物外周血中T细胞表面有 红细胞受体（即CD2分子），在体外能直 接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合 形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。
SRBC CD2
T T
B
左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞； 右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。
同位素法

掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制， 这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。 3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培 养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则 所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增 殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。
3H-TdR
同位素法优势
3H-TdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以

前者更能反映细胞增殖指数。 例，培养10个细胞，3天后A组为17个，B组为 13个，此为MTT的结果；3H-TdR的结果则为7： 3，A组细胞的增殖是B组的2.3倍。
实验步骤
1、鸡脾淋巴细胞悬液制备
淋巴细胞的分离
用1640培养液配 成106细胞/ml
与ELISA的区别
1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与 标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。 2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋 白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下 人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细 胞因子的细胞的频率 3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限 稀释法等更灵敏，能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该 蛋白的细胞。 4、捕获抗体不会影响活化细胞分泌细胞因子。
80 70 60 50 MOMP GTP 1B N2 空白
百分比
40 30 20 10 0 CD3 CD4 CD8 CD4/CD3 CD8/CD3
检测技术
3. 间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性 的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与 其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光 显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
原儿茶酸对SPF鸡的免疫刺激试验
20 **
Stimulation index
15 10 5 ** 0 20mg/kg ASP Control group
Poultry Science, 2012,91 :1604–1609
淋巴细胞分离液的原理
外周血中各种血细胞的密度不同，其中红 细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092， 淋巴细胞为1.074±0.001。 主要成分：葡聚糖，泛影葡甲胺，氢氧化 钠（1.0770-1.0800克/毫升）

T细胞表面受体
一、T细胞抗原受体
二、细胞因子受体
三、绵羊红细胞受体
四、有丝分裂原受体
T细胞亚群

辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/ 细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T 细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群 （CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+）、功能 亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLADR+）、凋亡亚群（CD95+）
淋巴细胞转化试验方法

形态计数法 MTT 法 同位素掺入法
形态计数法


加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算 转化为母细胞的百分数 细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增 加,即向淋巴母细胞转化。
MTT 法

MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。 MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑） -2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。细胞受到 ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱 氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成 蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周 围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定 细胞培养物的OD 值，测定波长570nm。根据OD 值 的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
图注：ELISPOT 法在检测低 频率产生细胞因子的细胞时 具有独一无二的敏感性。将 指定数目的能产生 IFN- 的T 细胞与一百万个抗原呈现细 胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上图）、胞质 内染法（中图）和 ELISA 法 （下图）分别测量产生 IFN的细胞的数目。
将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压
力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 酸 缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方 向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能 够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，
流式细胞术--- T细胞亚群
具有CD3抗原的T细胞：外周血成熟的T细 胞 具有CD4抗原的T细胞：TH（机体免疫应答 的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答， 活化的TH细胞可释放IL-2及IFN-r） 具有CD8抗原的T细胞：Tc（在TH辅助下特 异性杀伤或溶解靶细胞）
检测对象

免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术） T细胞亚群 （间接免疫荧光法，流式细胞术, 免疫磁珠） 细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR, Elispot） 免疫细胞活性 (淋巴细胞转化实验)
应用范围
1、测定患病个体的细胞免疫状态与水平，以 分析其发病机制； 2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细 胞免疫反应 3、筛选免疫增强剂或免疫抑制剂药物，或研 究化学药物、营养成分以及物理疗法对机体 免疫功能的影响 4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性 及效价
细胞免疫检测技术
欧长波 2012-11-16
课程内容
背景知识 免疫检测技术 实验内容

细胞免疫


Cell-mediated immunity is an immune response that does not involve antibodies but rather involves the activation of phagocytes, natural killer cells (NK), antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes, and the release of various cytokines in response to an antigen. 细胞免疫（cellular immunity） T细胞受到抗原刺激后，增 殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原 再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原 的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤 作用，统称为细胞免疫。
2、淋巴细胞增殖反应 将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液 分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA 作为对照。置 5% CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使 其终浓度为（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集 于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液， 用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。 3、数据处理及结果判定 以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示 实验孔cpm SI= ───────── 对照孔cpm 受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳 性。