20121115 细胞免疫检测技术
免疫细胞检测技术
免疫细胞检测技术哎呀，说起免疫细胞检测技术，这玩意儿可真是个神奇的东西。
你知道吗，我最近就体验了一把，感觉就像是做了一次身体里的“侦探游戏”。
那天，我走进医院，心里那个紧张啊，就像是要去见一个我暗恋已久的人一样。
医生让我做免疫细胞检测，说是能看看我身体里的“小卫士”们是不是在正常工作。
我心想，这玩意儿靠谱吗？但既然来了，那就试试吧。
检测的过程其实挺简单的，就是抽了点血。
护士小姐姐手法挺熟练的，一针下去，我都没感觉到疼，就是看着那鲜红的血液被抽出来，心里有点发毛。
不过，我告诉自己，这都是为了健康嘛，忍一忍就过去了。
等了几天，结果出来了。
医生拿着报告，一脸严肃地跟我解释。
我听着那些专业术语，什么T细胞、B细胞、NK细胞的，感觉就像是在听天书。
不过，医生看我一脸懵，就换了个说法，他说：“你看，这些免疫细胞就像是你身体里的警察，有的负责巡逻，有的负责抓坏人，有的负责清理现场。
现在，你的这些‘警察’都在正常工作，说明你的身体很健康。
”我听了这话，心里那个高兴啊，就像是中了彩票一样。
我心想，这免疫细胞检测技术还真是个好东西，至少让我知道我的身体里的“小卫士”们都很尽职尽责。
不过，医生也提醒我，虽然现在看起来不错，但也不能掉以轻心。
他说，就像警察也需要定期训练一样，我的身体也需要定期检查，保持健康的生活方式。
我点点头，心想，这跟我们平时工作一样，不能因为一时的成功就放松警惕，要时刻保持警觉。
所以，我现在更加注重健康了，也开始定期做免疫细胞检测。
每次看到那些“小卫士”们在报告上显示正常，我就感觉像是得到了一张健康通行证，心里那个踏实啊。
总之，免疫细胞检测技术对我来说，就像是给了我一个了解身体内部世界的窗口。
虽然听起来挺高大上的，但其实就跟我们平时生活中的小事一样，需要我们去关注，去维护。
这技术，真的挺神奇的，不是吗？。
细胞免疫检测技术
01
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主
要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答
反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激
01
吞噬功能检测
01
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具 有很强的吞噬功能，常用鸡红 细胞(CRBC)、白色念珠菌、 酵母细胞等作为吞噬颗粒，用 斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或 从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。
(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定
01 酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法
非特异性酯酶的测定 常用α-萘醋酸法
第二十五章 细胞免疫检测技术
E-花环实验原理
CD2 and CD58 • smilar structure • ligand of CD2---CD58
ligand of CD58---CD2 • CD2 also called SRBC-R(绵羊红细胞受体)
豚鼠T细胞表面有E受体=CD2. 家兔红细胞（RBC）表面有CD2的配体，即CD58. 将淋巴细胞与RBC按一定比例混合后，在一定条件下就
02 C o n A - - -----T 细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞
03 特 异 性 刺 激 物 ： 异种抗原 同种组织抗原
01
检测方法
02
形态法：刺激物 细胞（4-6天） 胞化
淋巴 母细
同位素法：PHA 淋 巴细胞（54h）
DNA合成期 + 3 H Td R 掺 入
（一）T淋巴细胞增殖试验
01. 原理： 01. 分化 01. 细胞变大 01. 核仁明显
免疫细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测技术嘿，咱今儿就来说说这免疫细胞功能检测技术。
你知道吗，咱身体里的免疫细胞那可真是一群了不起的“小战士”呀！它们时刻准备着和各种病菌、有害物质作战，保卫着咱们的身体。
那这免疫细胞功能检测技术呢，就像是给这些“小战士”来个大体检。
就好比咱去医院体检，能知道自己身体哪儿好哪儿不好，这检测技术也能让咱清楚免疫细胞的状态咋样。
你想想看，要是咱能清楚地知道这些“小战士”的战斗力强不强，是不是就能更好地了解自己的身体状况啦？要是检测出来它们有点弱，那咱就得想办法给它们加加油、鼓鼓劲呀！不然，敌人来了可咋办呢？这检测技术有很多种方法呢。
比如说，有一种可以检测免疫细胞的增殖能力。
你就理解成看看这些“小战士”能不能快速地增加数量，人多力量大嘛！要是它们增殖得快，那说明它们很有活力呀，咱就放心不少。
还有检测它们杀伤能力的。
这就好比看这些“小战士”能不能一下子就把敌人给消灭掉，要是它们的杀伤能力强，那咱身体里的那些坏家伙就不敢随便捣乱啦。
再比如说，检测免疫细胞分泌细胞因子的能力。
细胞因子就像是“小战士”们的秘密武器，能帮助它们更好地作战。
要是分泌得多，那它们打起仗来肯定更厉害呀！那这检测技术重要不？那可太重要啦！就好像你要去打仗，总得先知道自己手里的武器好不好使，自己的士兵厉不厉害吧？这检测技术就是帮咱了解免疫细胞这个“军队”的情况呀。
要是没有这个技术，咱就像蒙着眼睛走路一样，都不知道自己身体的免疫防线到底咋样。
万一有点啥问题，咱都不知道该怎么应对呢。
你说，这免疫细胞功能检测技术是不是很神奇？它就像是给咱身体里的免疫系统开了一扇窗，让咱能看到里面的情况。
而且，随着科技的不断进步，这检测技术肯定也会越来越先进，能检测的东西也会越来越多。
咱可得好好重视这个技术呀，毕竟身体是自己的，咱得对自己负责呀！别觉得这事儿离你很远，说不定哪天你就需要它来帮你了解自己的身体呢。
免疫细胞功能检测技术，真的是咱身体健康的好帮手呀！你说是不是呢？。
Western_blot_实验技术-20121115(精)
“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现 象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
显影
1、HRP-ECL发光法： 将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于 片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶 片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底 片完全定影，清水冲净晾干。
2、图片分析： 标定Marker，进行分析与扫描。
Western blot 实验技术
曹 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测
反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利
用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
转膜系统
Mini Trans-Blot cell components
聚丙烯酰胺胶-膜三明治
•半干转 •湿转
快速，约10-30min
较稳定，300 mA，1.5-2h
封闭
原理： 脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封 闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高，即脱脂奶粉中的蛋白通过 疏水作用与膜上没有蛋白的部分结合，从而可以阻止一抗与膜通过疏水作 用结合而产生很高的背景。 种类： 常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, gelatin, tween-20等,一般用non-fat milk. 实验步骤： 5%脱脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封闭过夜 或室温1~2小 时。 注意：奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白 时，则不能用其作为封闭液。
免疫细胞功能检测技术课件.ppt
vv
(二)吞噬功能检测
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的 吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠 菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴 法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨 噬细胞。
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
vv
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞
体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、 破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫 前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血 清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判 断受检者体内B细胞的功能。
vv
三、NK细胞活性测定
形态法 酶释法 荧光法 同位素法 化学发光法
vv
(一) 细胞运动功能——趋化功能检测
1.原理：
vv
2. 方法： 滤膜渗透法（Boyden 小室法）
琼脂糖平板法
vv
(二)吞噬和杀菌功能测定 1．显微镜检查法：
常用细胞免疫检测方法及其用途
常用细胞免疫检测方法及其用途细胞免疫检测方法是一种用于研究免疫系统的方法，它可以测量细胞的免疫功能、监测免疫细胞的数量和活性，并评估机体对感染、肿瘤等疾病的免疫应答能力。
常用的细胞免疫检测方法包括流式细胞术、荧光显微镜技术、免疫组化、PCR等。
1.流式细胞术：流式细胞术是一种广泛应用的多参数细胞分析方法。
通过使用荧光标记抗体，它可以同时检测细胞表面分子、细胞内分子和细胞功能。
流式细胞术可以用于检测免疫细胞表面分子的表达情况，如CD4、CD8、CD16、CD56等，也可以用于分析细胞内分子的表达水平，如细胞因子、信号转导分子等。
它对于免疫细胞的数量和活性的定量分析具有非常重要的意义。
2.荧光显微镜技术：荧光显微镜技术是一种常用的细胞免疫检测方法，它可以通过标记荧光染料或荧光标记的抗体来检测和定量细胞表面分子的表达。
荧光显微镜技术可以用于检测免疫细胞表面分子的局部化和定位，研究细胞间相互作用和免疫细胞与病原体的相互作用，如免疫细胞的吞噬功能等。
3.免疫组化：免疫组化是一种通过使用荧光或酶标记抗体来检测和定位组织中特定分子的方法。
它可以用于检测免疫细胞在组织中的分布和定位，研究免疫细胞的定向迁移和组织的免疫反应。
免疫组化可以用于检测免疫细胞相关的疾病，如肿瘤等的诊断和评估。
4.PCR：聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的方法。
它可以用于检测和定量细胞内基因的表达水平，推断免疫细胞的功能状态。
PCR可以用于检测免疫细胞中特定基因的表达，如细胞因子、信号转导分子等。
它对于研究免疫细胞功能和免疫反应的调控机制具有重要的意义。
细胞免疫检测方法在免疫学研究、疾病诊断和治疗等领域具有广泛的应用价值。
它可以帮助我们更好地了解免疫细胞的数量、分布和功能状态，评估机体的免疫应答能力，研究免疫细胞与病原体的相互作用，以及评估新药对免疫系统的影响。
细胞免疫检测方法的发展为免疫学研究和临床诊断带来了便利，也为新药的发现和疾病的治疗提供了重要的技术支持。
细胞免疫检测.
二. 细胞免疫测定的方法：
方法
体内试验: 皮内试验
体外试验: 免疫功能的测定 淋巴细胞计数
细胞免疫功能测定
T细胞转化试验 巨噬细胞移动抑制试验 混合淋巴细胞培养 K与NK细胞活性检测
淋巴细胞 计数测定
T细胞花结形成试验 细胞表面受体测定 B细胞膜表面IgG测定
细胞表面分化抗原 T淋巴细胞亚群测定 B细胞表面分化抗原测定
2. NK细胞可引发自身免疫病
过去一般认为多数自身免疫性疾病与自 身反应性T细胞的产生有关。随着NK细胞 识别机制的发现，尤其是HLAI类分子变化 与NK细胞关系的阐明，少数学者推测自身 反应性NK细胞或正常组织因某种原因而引 起HLAI类分子的丢失也许是引发自身免疫 性疾病的原因。
NK细胞的发育与重大疾病的重新解 释
七．淋巴细胞亚群的检测方法
1．免疫荧光检测法： 荧光显微镜
流式细胞仪：快速、准确、简便。 2．免疫组化法：
碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶（APAAP）免 疫桥联染色法； 免疫金银染色法（IGSS）。
小结
一. 细胞免疫概念 二.细胞免疫检测种类 三.T淋巴细胞分群、功能及临床意义(★) 四.B淋巴细胞 五.淋巴细胞分化抗原在白血病免疫学分型中的
(二) 肿瘤病人治疗效果的判定及预后
免疫功能正常的病人，一般预后较好， 反之预后差。
接受常规治疗的肿瘤病人，若治疗引起 了免疫抑制，则这种病人的预后较差，缓 解期的白血病病人，其免疫功能突然下降， 是白血病复发的信号。
六. 淋巴细胞表面标志物在白血病免疫学 分型中的作用
B 系细胞白血病的相关性标记：CD10、 CD19、CD20、CD22 T 系细胞白血病的相关性标记：CD2、 CD3、CD5、CD7、CD4、CD8
免疫细胞检测技术
免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。
各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。
本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。
一．免疫细胞的分离免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。
它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是分离各种免疫细胞的基础。
细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面的蛋白质(表面标记)来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。
根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离出来。
免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于细胞表面标记的分离方法。
基于细胞物理性状的分离方法(一)根据各种细胞比重的差异1.自然沉降法2.密度梯度离心法人外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.00左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075左右。
利用密度在l.077万±0.001之间近于等渗的Ficoll-Hypque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。
血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o（如图1-1所示）图1-1 淋巴细胞分离示意图3.改变细胞密度法巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T 细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心将T细胞分离。
《细胞免疫检测技术》课件
细胞免疫检测技术在医学领域广泛应用于感染性疾病、肿瘤 、自身免疫性疾病等的诊断、治疗监测和预后评估。
发展趋势
自动化与高通量
随着技术的发展，细胞免疫检测 正朝着自动化、高通量、高灵敏 度的方向发展，以提高检测效率
和准确性。
标准化与规范化
为了确保检测结果的可靠性和可比 性，需要建立和完善细胞免疫检测 技术的标准化和规范化体系。
机遇
随着科技的不断进步，新的技术和方法不断涌现，为细胞免疫检测技术的发展提供了更多的机遇和可能性。
未来研究方向与展望
研究方向
未来细胞免疫检测技术的研究方向主要包括 提高检测的灵敏度和特异性、降低检测成本 、开发新的技术和方法等。
展望
随着科技的不断进步和研究的深入，细胞免 疫检测技术有望在未来得到更广泛的应用， 为疾病的诊断、治疗和预防提供更多的帮助 和支持。
《细胞免疫检测技术 》PPT课件
xx年xx月xx日
• 引言 • 细胞免疫检测技术概述 • 细胞免疫检测技术的基本方法 • 细胞免疫检测技术在医学中的应
用 • 案例分析 • 总结与展望
目录
01
引言
课程背景
01
细胞免疫检测技术是生物学、医 学等领域的重要研究手段，广泛 应用于疾病诊断、治疗和预防。
肿瘤免疫诊断中常用的细胞免疫检测技术包括流式细胞术、 免疫组织化学、酶联免疫吸附试验等。这些技术能够检测肿 瘤细胞表面的标志物、分泌的细胞因子和免疫细胞浸润等情 况，为肿瘤的诊断和治疗提供重要依据。
自身免疫病诊断
自身免疫病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身 组织损害的疾病。细胞免疫检测技术在自身免疫病诊断中 具有重要作用。
常用的细胞免疫检测技术包括混合淋巴细胞培养、细胞毒试验、抗体检测等。这 些技术能够检测供、受体之间的免疫差异和排斥反应的标志物，为移植后管理和 治疗提供指导。
免疫细胞功能检测技术
淋巴 细胞
淋巴 母细胞
空泡 空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞 未转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
细胞大小(直径μ m) 12～20
过渡型
12～16 6 ～8
核大小、染色质
核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡
增大、疏松
清晰、1～4个 有或无 增多、嗜碱 有或无
增大、疏松
第三节 免疫细胞功能 检测的临床应用
肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预 后监测
组织器官移植后排斥反应的早期发现
Thank You!
第15章
免疫细胞功能检测技术
医大一院检验科
本章内容
免疫细胞功能检测技术
淋巴细胞的功能检测
吞噬细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测的临床应用
免疫细胞
T细胞 中性粒 细胞
捕获抗原，处理 抗原，提呈给淋 巴细胞或表现其 他免疫功能
B细胞
识别特异性抗 原 ，被激活显 示出特异性应答
淋巴 细胞群
吞噬 细胞
巨噬 细胞
一、T细胞功能的检测
1
T细胞增殖试验
2
3 4
T细胞分泌功能测定
T细胞介导的细胞毒试验 体内试验
（一）T细胞增殖试验
刺激 DNA合成 分化 细胞变大 细胞浆扩大 有丝分裂 原/抗原
淋巴 细胞
淋巴 母细胞
空泡 空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞 未转化的淋巴细胞
2．非特异性酯酶的测定 用IFN-γ 激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR 标记DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。
细胞毒作用测定
基于细胞分析的免疫细胞检测技术
基于细胞分析的免疫细胞检测技术随着现代医学发展的不断推进，诊断技术也得到了质的提升。
其中，免疫细胞检测技术便是一个突破性进展，它借助于现代的分析技术和设备，能够迅速、准确地检测免疫系统中的各类细胞，实现个性化治疗，成为越来越多疑难杂症的救命稻草。
基于细胞分析的免疫细胞检测技术是指通过对免疫系统中各种细胞的数量、功能和分子特征等方面进行细胞分析，来判断患者免疫健康状况的新技术。
其中，细胞免疫学技术是基于细胞分析的免疫细胞检测技术的核心。
目前，细胞免疫学技术广泛应用于临床医学中，主要分为三个方面：一是用于疾病诊断与治疗；二是用于疫苗监测与控制；三是用于免疫学研究和免疫学新药的研发。
在疾病诊断与治疗领域，细胞免疫学技术主要应用于自身免疫性疾病、肿瘤和感染性疾病等患者的诊断和治疗。
比如，通过细胞免疫学技术可以快速检测到自身免疫疾病中某些特殊类型的免疫细胞，并根据这些细胞特征来选择合适的治疗方案。
在肿瘤治疗方面，免疫疗法已经成为现代肿瘤治疗的重要手段。
针对某些特定的肿瘤，通过细胞免疫技术可以发现患者免疫系统中的某些特殊细胞，并利用这些细胞来制定个性化的治疗方案。
在疫苗监测与控制领域，细胞免疫技术应用广泛，是疫苗研发、监测和控制的核心。
在疫苗研发阶段，通过细胞免疫学技术可以评估疫苗对患者的免疫反应情况，为疫苗的临床应用提供科学依据。
在疫苗监测方面，细胞免疫学技术可以判断患者接种疫苗后，疫苗免疫效果的好坏，并根据检测结果来调整公共卫生战略。
在疫苗控制方面，细胞免疫学技术也可以帮助卫生部门对疫苗质量进行监督管理。
在免疫学研究和新药研发领域，细胞免疫学技术也扮演着重要角色。
比如，在疾病治疗方面，通过细胞免疫学技术可以评估细胞因子和介质等分子的水平，从而更好地了解疾病的发生机制，为新药研发提供理论依据。
此外，利用自身免疫细胞进行免疫治疗也成为了热门的研究方向，而在这个领域，细胞免疫学技术的应用则将成为必不可少的手段。
医学专题免疫细胞功能检测技术概述
内容(nèiróng)总结
免疫细胞功能检测技术。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。T细胞（负责 细胞免疫功能）。未转化和转化淋巴细胞的形态特征。PWM -------T、 B细胞。LPS ------B细胞。肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力。可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌 (fēnmì)，并可定量。体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎 链球菌菌苗等。常用靶细胞: K562细胞株。二 吞噬细胞功能检测技术。Thanks
1. 原理 ： (yuánlǐ)
淋巴细胞
刺激物
DNA合成(héchéng)
分化
母细胞
第五页，共四十三页。
细胞变大
细胞浆扩大
空泡 核仁明显
核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞 淋巴母细胞 过渡型
未转化的淋巴细胞
细胞大小(直径μm) 12～20
12～16
6～8
核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
增大、疏松
增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
有或无
无
增多、嗜碱
增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
第六页，共四十三页。
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化(zhuǎnhuà)的刺激物
非特异性刺激物：
PHA ------T细胞 ConA -------T细胞
PWM -------T、 B细胞
➢ 细胞趋化功能的检测 ➢ 吞噬(tūnshì)和杀菌功能的检测
第三十页，共四十三页。
(一) 细胞运动功能(gōngnéng)——趋化功能检 测
检验第十四章 免疫细胞检测技术
2. CD抗原检测：B细胞抗原有CD19、CD22 和CD5等分化抗原。用相应的单克隆抗体， 通过间接荧光免疫法或酶免疫组化技术 检测。
* 用FITC标记的CD19与PE标记的CD5单 克隆抗体，可在流式细胞仪上进行B细胞 总数及其亚群的测定。
第三节 淋巴细胞功能检测
• 一、T淋巴细胞功能检测 负责细胞免疫的T淋巴细胞具有多种生物学功能，
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而的
• 二、B淋巴细胞数量检测 1.SmIg的检测 2.CD抗原检测 3.Fc受体和检测受体检测 4.小鼠红细胞受体检测
1. SmIg的检测：SmIg为B细胞所特有 方法: 荧光免疫显微镜检或酶组化法 原理:B细胞＋荧光素或酶标记的抗人IgM, IgD抗体 正常人外周血中SmIg＋细胞为8％－12％。
Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 处理的硅 胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll 混悬液的硅胶颗粒大小不一，经高速离心后，可 形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离
PBMC
........................................................... . ......... . .
免疫状态。
1、形态法
标本：外周血或 单个核细胞 +
PHA
无PHA
37℃ 72h
取培养细胞涂片染色镜检
观察细胞形态学改变
• ② 操作步骤
• 将外周血液或分离的单个核细胞与适量PHA混 合，置37。C培养72小时，取培养细胞作涂片 染色镜检。根据细胞的大小、核与胞浆的比例、 胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征， 分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝 分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者 为转化细胞。
【精编版】1细胞免疫检测技术共34页PPT
【精编版】1细胞免疫检测 技术
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
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T细胞表面受体
一、T细胞抗原受体
二、细胞因子受体
三、绵羊红细胞受体
四、有丝分裂原受体
T细胞亚群
辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/ 细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T 细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群 （CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+）、功能 亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLADR+）、凋亡亚群（CD95+）
CD4+T细胞 分离柱
CD4-T细胞
磁珠标记目的细胞
未标记细胞先行流出
移出磁场后收 集目的细胞
二. 阴性分选
磁珠标记非目的细胞
目的细胞先行流出
检测技术
5. 固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT
细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此 细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分 解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的 二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲 和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了 细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系 统对斑点的分析后得出结果.
同位素法
掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制， 这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。 3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培 养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则 所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增 殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。
细胞免疫检测技术
欧长波 2012-11-16
课程内容
背景知识 免疫检测技术 实验内容
细胞免疫
Cell-mediated immunity is an immune response that does not involve antibodies but rather involves the activation of phagocytes, natural killer cells (NK), antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes, and the release of various cytokines in response to an antigen. 细胞免疫（cellular immunity） T细胞受到抗原刺激后，增 殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原 再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原 的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤 作用，统称为细胞免疫。
将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压
力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 酸 缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方 向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能 够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，
流式细胞术--- T细胞亚群
具有CD3抗原的T细胞：外周血成熟的T细 胞 具有CD4抗原的T细胞：TH（机体免疫应答 的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答， 活化的TH细胞可释放IL-2及IFN-r） 具有CD8抗原的T细胞：Tc（在TH辅助下特 异性杀伤或溶解靶细胞）
B细胞没有红细胞受体，但有免疫球蛋白Fc 受体和补体C3受体，故可用抗红细胞抗体 （A）或者补体（C）搭桥，形成EA玫瑰花 环实验和EAC玫瑰花环实验。
检测技术
2.流式细胞术
定义：流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的
高科学技术,• 它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细 胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞 大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内 DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间 内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分 析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、 免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激 光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分 选或分析。
原儿茶酸对SPF鸡的免疫刺激试验
20 **
Stimulation index
15 10 5 ** 0 20mg/kg ASP Control group
Poultry Science, 2012,91 :1604–1609
淋巴细胞分离液的原理
外周血中各种血细胞的密度不同，其中红 细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092， 淋巴细胞为1.074±0.001。 主要成分：葡聚糖，泛影葡甲胺，氢氧化 钠（1.0770-1.0800克/毫升）
检测对象
免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术） T细胞亚群 （间接免疫荧光法，流式细胞术, 免疫磁珠） 细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR, Elispot） 免疫细胞活性 (淋巴细胞转化实验)
应用范围
1、测定患病个体的细胞免疫状态与水平，以 分析其发病机制； 2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细 胞免疫反应 3、筛选免疫增强剂或免疫抑制剂药物，或研 究化学药物、营养成分以及物理疗法对机体 免疫功能的影响 4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性 及效价
检测技术
1. E玫瑰花环形成试验 erythocyte rosette test
实验原理：人和动物外周血中T细胞表面有 红细胞受体（即CD2分子），在体外能直 接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合 形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。
SRBC CD2
T T
B
左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞； 右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。
与ELISA的区别
1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与 标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。 2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋 白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下 人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数， 1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细 胞因子的细胞的频率 3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限 稀释法等更灵敏，能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该 蛋白的细胞。 4、捕获抗体不会影响活化细胞分泌细胞因子。
用培养液调成 106细胞/ml
鸡外周血淋巴细胞增殖实验
1.加液： 2.离心： 3.计数 4. 铺板 5. 检测
3H-TdR
同位素法优势
3H-TdR=增殖细胞数；MTT=总细胞数。所以
前者更能反映细胞增殖指数。 例，培养10个细胞，3天后A组为17个，B组为 13个，此为MTT的结果；3H-TdR的结果则为7： 3，A组细胞的增殖是B组的2.3倍。
实验步骤
1、鸡脾淋巴细胞悬液制备
淋巴细胞的分离
用1640培养液配 成106细胞/ml
检测技术
6. T淋巴细胞转化实验
T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和 有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使 相应淋巴细胞克隆发生增殖。
植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）， 抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选 择性地刺激T细胞增殖； 抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、 脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞 发生增殖； 美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对 T、 B细胞的增殖均有刺激作用。
80 70 60 50 MOMP GTP 1B N2 空白
百分比
40 30 20 10 0 CD3 CD4 CD8 CD4/CD3 CD8/CD3
检测技术
3. 间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性 的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与 其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光 显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
图注：ELISPOT 法在检测低 频率产生细胞因子的细胞时 具有独一无二的敏感性。将 指定数目的能产生 IFN- 的T 细胞与一百万个抗原呈现细 胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上图）、胞质 内染法（中图）和 ELISA 法 （下图）分别测量产生 IFN的细胞的数目。
淋巴细胞转化试验方法
形态计数法 MTT 法 同位素掺入法
形态计数法
加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算 转化为母细胞的百分数 细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增 加,即向淋巴母细胞转化。
MTT 法
MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。 MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑） -2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。细胞受到 ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱 氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成 蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周 围，经溶剂溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定 细胞培养物的OD 值，测定波长570nm。根据OD 值 的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
2、淋巴细胞增殖反应 将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200μL/孔，每一份脾细胞悬液 分装6个孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA 作为对照。置 5% CO2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使 其终浓度为（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多头细胞收集器将细胞取集 于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7mL闪烁液， 用液闪仪测定每分钟脉冲数（cpm）。 3、数据处理及结果判定 以每分钟脉冲数（cpm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示 实验孔cpm SI= ───────── 对照孔cpm 受试样品组的SI值显著高于对照组的SI值，即可判定该项实验结果阳 性。