重组腺病毒生产技术研究进展

2004 年 10月The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2004

重组腺病毒生产技术研究进展

祁丽，顾铭，丛威

(中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室，北京 100080)

摘要：目前基因治疗，尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术

的发展，对癌症在基因水平上的认识不断深化，发现了很多对治疗癌症有帮助的基因，但临床面

临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统，将这些治疗基因有

效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大

量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数

等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展.

关键词：基因治疗；重组腺病毒载体

中图分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)05−0475−06

1 前言

基因治疗是近年来兴起的一种针对单基因和多基因遗传病、心血管疾病、恶性肿瘤和一些传染病的新的治疗模式，目的是将外源治疗基因导入靶细胞，在体内产生疗效. 基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统. 到目前为止，病毒载体在基因治疗中仍然是最有效的基因导入系统[1]. 腺病毒就是已经用于基因治疗的载体之一，与其它病毒载体相比，腺病毒载体一个主要优势是在包装细胞中能获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞，目前应用最多的是Ad5[2]. 用外源DNA置换出一定长度的病毒基因片断及获得重组的腺病毒，根据腺病毒载体中的病毒基因置换程度，可将其分为第一代、第二代和第三代. 第一代腺病毒载体去除了基因序列中的E1和E3区，包装外源基因的能力较小，在8.5 kb以内，主要用于单基因疾病的治疗[3]，缺点是导入基因的表达时间短和引起宿主的免疫反应，导致直接的细胞致病变作用(Cytopathic Effects，CPE)，另外，在293细胞内同源重组作用导致野生腺病毒(Replicative Competent Adenovirus，RCA)的产生[4]. 为了避免上述缺点，第二代腺病毒载体进一步去除了E2a, E2b或E4，载体的容量和安全性比第一代有所改进，但是其介导的外源基因的转染和表达时间并没有明显延长，而且产生重组病毒滴度低，另外保留的病毒基因仍有低水平的表达并引起细胞免疫反应[5,6].第三代腺病毒缺失全部或大部分腺病毒基因，或者包装腺病毒微染色体系统，这种载体缺失了病毒蛋白，所以很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难. 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体.

重组腺病毒的生产过程主要包括包装细胞的培养、病毒感染、病毒的分离纯化和病毒计数及滴度测定等几个主要步骤. 以下从腺病毒的感染机制、生产和纯化计数几个方面论述重组腺病毒载体的生产技术.

收稿日期：2003−09−28，修回日期：2003−11−05

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(编号: 2001AA217121)

作者简介：祁丽(1979−)，女，河南省原阳县人，硕士研究生，生物工程专业；丛威，通讯联系人，E-mail: weicong@.

2 腺病毒感染机制

野生腺病毒的基因组双链DNA长度为36 kb[1]. 腺病毒感染细胞主要有以下几个步骤：(1) 病毒的扩散与在细胞表面吸附. 这一步中细胞密度、直径、培养基粘度和组成是比较关键的参数；(2) 病毒颗粒与细胞膜特异受体结合后经内吞作用进入细胞，随即脱衣壳，病毒DNA进入细胞核中，这一步非常快，大约在10 min之内[7]；(3) 基因转录与病毒DNA复制，这一步又可以分为几部分，0∼2 h，E1区的转录，E1区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有调控作用，2∼6 h，早期转录区基因E1b, E2a, E2b, E3, E4的转录，这些基因的功能是控制宿主细胞的代谢和病毒DNA复制，有报道[8]证实感染6∼8 h后宿主细胞的DNA复制完全停止，用含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体感染细胞后6 h即可在线检测到报道基因的表达，20 h后达到最大表达量[9,10]，说明病毒基因的复制与翻译在20 h时就已经完成.

3 宿主细胞感染腺病毒后的代谢变化

细胞感染腺病毒后，细胞干重、蛋白和DNA含量、细胞大小都有不同程度的增加，如293细胞在不含血清的培养基中，细胞感染病毒后直径从15 µm增至17 µm[10]. 在感染24∼48 h后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了30%∼100%[11,12], O2的消耗和ATP的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量[13].

4 重组腺病毒的生产方法

生产重组腺病毒通常所使用的细胞系有贴壁依赖性细胞和悬浮培养细胞，目前使用最广的是293细胞(人胚胎肾细胞)，使用这一细胞的优点是可以获得很高的病毒滴度，缺点是由于同源重组能产生野生型腺病毒. 一些实验室建立了293悬浮培养细胞系，还有在293细胞的基础上建立了911细胞[14]. 另一个较常用的是PER.C6®(人胚胎视网膜)细胞 [15],这个细胞株最大程度地减少了野生型腺病毒的产生几率，但是该细胞已经申请了专利，使用该细胞株必须获得授权.另外已经构建的A549细胞(肺癌细胞系)可以包装E1区缺陷的腺病毒，同时降低了野生腺病毒的产生几率[16]. 以下从使用的细胞系分别说明重组腺病毒的生产方法.

4.1 贴壁依赖型细胞

通常贴壁依赖型细胞培养方法是用方瓶和转瓶，也可以在搅拌条件下使用微载体进行培养. 贴壁依赖型细胞一般用于细胞外分泌蛋白的工艺，当用于腺病毒载体的培养时，只能收集细胞后再进行破碎使腺病毒释放到介质中，但是这种方法由于贴附表面的限制放大比较困难，而且培养基中的血清增加了对下游分离纯化工艺的要求.

通常在贴壁培养条件下293细胞的接种密度大约在(1∼1.5)×104个/cm2，当细胞增殖到105个/cm2时接种病毒，贴壁培养的细胞比悬浮培养的细胞病毒产率要高一些，前者为7000∼12000 pfu/细胞，后者为5000 pfu/细胞. 但是由于贴壁面积的限制，总的病毒产量要低于悬浮培养[17].

微载体对贴壁依赖型的细胞提供了更大的贴附表面积，Nadeau[17]评价了293细胞在不同的微载体系统的生长状况，认为Cytodex−3相对于其它的微载体是最优的. 但是293细胞本身的贴壁能力很弱，细胞很难在微载体间进行迁移.

4.2 悬浮培养细胞

相对于贴壁培养，悬浮培养更适于培养规模的放大，目前，对贴壁依赖型细胞进行改良，已