分子标记技术的种类

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。

理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本与使用成本尽量低廉;⑧在实验室内与实验室间重复性好。

目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具有各自的优点与
不足。

其特点比较见表一。

1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。

其原理就是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA 酶切片段,通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。

进行RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。

目前RFLP 的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境与发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型与杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。

其缺点就是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。

2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)
20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。

1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。

其原理就是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。

随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量与大小发生改变,表现出多态性。

用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。

与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性与基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。

但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性与重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子与杂合子。

RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。

将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。

1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。

SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆与测序,设计一对互补于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物,扩增原来模板DNA,产生SCAR-DNA片段。

相对于RAPD,SCAR由于使用更长的引物与
更高的退火温度而具有更高的可靠性与可重复性,对反应条件不敏感,且可以将显性RAPD标记转变为共显性的SCAR标记,从而提高遗传作图效率。

此外,还有任意引物PCR标记(Arbitary primer,AP-PCR)技术与DNA扩增指纹(DNA Amplified fingerprinting,DAF)技术,前者使用20或30bp的任意引物随机扩增基因组DNA,后者用5或8bp的任意引物随机扩增基因组DNA。

这些技术彼此相似,都能提供DNA的多态性信息,用于遗传图谱构建或基因定位等。

当然RAPD标记技术使用最广泛。

3 简单重复序列标记(Simple Sequence Repeat,SSR)
1982年,Hamade等人发现了简单重复序列标记(SSR)技术,或称微卫星序列标记(Microsatellite sequence,MS),或短串联重复标记( Short Tandem Repeat,STR)。

真核生物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列[5]。

按重复基序的长度可将串联重复序列分为卫星DNA(基序100-300bp)、小卫星DNA(基序10-60bp)、微卫星DNA(基序1-6bp)。

与中卫星DNA(由不同大小串联重复组成)等。

微卫星就是由DNA复制或修复过程中DNA滑动与错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的。

微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。

尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置,但其两端序列多就是保守的单拷贝序列,根据这两端的序列设计一对特异引物,通过PCR技术将期间的核心微卫星DNA序列扩增出来,利用电泳分析技术就可以得到其长度的多态性,此即SSR标记的原理。

SSR 标记具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点,但由于其需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆与测序分析,以便设计相应的引物,这就是非常费时、费力与代价昂贵的工作,没有足够的投资、人力与时间,就是不可能实现的,因而给它的利用带来了一定困难。

简单重复序列间区标记(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR)可以克服以上提到的SSR标记的缺点,或称锚定简单重复序列标记(Anchored Simple Sequence Repeat,ASSR)。

在SSR序列的3’端或5’端加上一个2-4bp的随机核苷酸,形成微卫星DNA的锚定引物,在PCR反应中,锚定引物可引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行扩增。

所扩增的inter SSR区域的多个条带通过电泳可分辨,呈现出扩增带的多态性。

该方法不需知道DNA序列即可用锚定引物扩增。

4 扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)
1993年,荷兰科学家Zbaeau与Vos发现了一种检测DNA多态性的新方法,即扩增片段长度多态性标记(AFLP)。

AFLP就是RFLP与PCR相结合的产物,其原理就是先用两种限制性内切酶(低频剪切酶与高频剪切酶,前者识别为点为6bp,后者为4bp)双酶切基因组DNA产生不同大小的DNA片段,酶切产物玉双链人工接头连接,作为扩增反应的模板DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加 1-3bp选择性核苷酸作引物对模板DNA 再进行选择性扩增,电泳分离获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。

引物由三部分组成:与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别位点序列、引物3’端的选择碱基序列(1-10bp)。

接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。

该技术的独特之处在于所用的专用引物在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。

AFLP结合了RFLP与RAPD两种技术的优势,具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。

但它的技术费用昂贵,对DNA的纯度与内切酶的质量要求很高。

尽管AFLP技术诞生时间较短,但可称之为分子标记技术的又一次重大突破,被认为就是目前一种十分理想、有效的分子标记。

5 表达序列标签标记(Expressed Sequence Tag,EST)
1991年,Adams等人用EST对表达序列进行了研究,她们从人脑cDNA文库中随机挑取600个克隆,测序合成EST,从而发现了
一系列在脑部表达的新基因并由此建立了表达序列标签标记(EST)技术。

其原理就是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后,大规模随机挑取cDNA克隆,对其3’端或5’端进行序列,得到的序列与数据库中已知序列比对,从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等生命过程的认识。

ES T即就是通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行测序后所得的部分cDNA的3’端或5’端序列,一般长为300-500bp。

每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段。

EST 标记分为两类:一就是以分子杂交为基础,用EST本身作为探针与经过酶切后的基因组DNA杂交而产生;二就是以PCR为基础,按照EST的序列设计引物对植物基因组特殊区域进行PCR扩增而产生。

利用EST标记,对EST序列进行分析可得到大量的基因表达信息。

与其她分子标记相比,EST 标记的优越性在于直接与一个表达基因相关,且大量的EST可累积建立一个新的数据库,为表达基因的鉴别等研究提供大量信息。

由于EST来源于cDNA克隆,因此它部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式。

通常EST还可在Gen Bank及PIR(Protein Information Resource,PIR)等数据库中进行比较分析,以获得其可能的功能、表达模式等信息。

但EST标记所获得的基因组信息不完整,因为如调控序列、内含子等序列并不在EST序列中。

且EST标记需要进行大批量的测序,实验费用较高。

6 单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)
1998年,在人类基因组计划的实施过程中产生了单核苷酸多态性标记(SNP)技术。

SNP就是指在基因组中同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失产生的DNA序列多态性。

以这样的DNA序列多态性特征作标记即可区分两个个体遗传物质的差异,此即SNP标记的原理。

SNP标记的优点在于多态性数量很丰富;广泛分布于植物基因组中;与串联重复的微卫星位点相比,SNP就是高度稳定的。

结合基因芯片技术后可快速、规模化的筛查不同个体的遗传多样性。

但其在应用中还存在一些问题,如SNP作图时需要大量的有代表性的个体,因此需要进行大量的单个扩增反应,且得到大量的SNP信息后,难以
确定用哪个SNP解决错误的遗传问题。

7 相关序列扩增多态性标记( Sequence Related Amplified Polymorphism,SRAP)与目标区域扩增多态性标记(Target Region Amplified Polymorphism,TRAP)
2001年,美国加州大学蔬菜作物系的Li与Quiros博士提出了一种基于PCR的新型分子标记技术,即相关序列扩增多态性标记(SRAP)技术。

其原理就是通过设计一对特异的引物对基因组的外显子、内含子与启动子区域进行PCR扩增,扩增产物通过电泳分析后可显现出因个体不同及物种的内含子、启动子与间隔序列不同而产生DNA多态性。

SRAP上游引物长17bp,其中5’端的前10bp就是一段没有任何特异性的填充序列与紧接着它的CCGG序列共同组成核心序列,在3’端有3个选择碱基。

下游引物长18bp,其中核心序列包括11bp的填充序列与AATT特异性序列,在3’端同样有3个选择碱基。

上游引物中的CCGG序列可与开放阅读框区域中的外显子特异性结合,下游引物中的AATT序列特异结合于富含AT区的内含子与启动子。

这样的上下游引物可以同时对外显子、内含子与启动子区域进行特异性扩增。

SRAP 作为一种新型的分子标记,其优点就是多态性高;具有高频率的共显性;相对于类似RAPD、ISSR的显性标记,SRAP能提供更多的遗传信息;DNA需要量少,仅需20-30ng,并且对DNA纯度要求低;更简单,检测方法多样化;与AFLP相比,不用酶切、连接、预扩等步骤;同时SRAP扩增产物检测可以用变性聚丙烯酰胺凝胶,也可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶;花费少,改变SRAP引物3’端的3个选择性碱基可设计大量的引物序列,同时上游引物与下游引物可以自由组合,因此,大大减少了合成引物的费用,同时也提高了引物的使用率。

2003年,美国农业部北方作物科学实验室的Hu与Vick又提出了基于PCR技术与EST的目标区域扩增多态性标记(TRAP)技术。

TRAP标记即就是以EST的序列设计引物,对基因组特殊区域进行PCR扩增而产生的分子标记技术。

其原理就是利用两个长度为16-20bp的固定引物与一个随机引物进行组合,固定引物主要就是根据从EST数据库中选择的所需序列来设计,随机引物的设计与SRAP引物设计方法相似,可与内含子或外显子进行配对。

以目标区域为模板,可扩增出围绕目标候选基因的序列,产生TRAP多态性。

TRAP与RAPD、ISSR、AFLP及SRAP等标记的不同主要在于TRAP的固定引物设计时需要知道所研究植物的EST 序列信息,但相对于RAPD、AFLP等标记,TRAP标记具有操作简单、重复性好、多态性高、效率高等优点。

注:表中“-”指未找到数据或不需使用。