生物技术实验

实验一酵母细胞的固定化
1.实验目的
掌握酵母细胞的固定化方法。

2.原理
利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。

这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。

其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。

通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。

3.试剂和仪器设备
鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计
4.实验步骤
（1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。

（2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。

（3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。

（4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。

（5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。

5.实验数据及其处理
记录固定化酵母细胞的质量。

固定化酵母细胞的质量为：0.75g
6.问题讨论
如何验证固定化酵母细胞的催化能力？
(1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。

如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。

（2）观察发酵的葡萄糖溶液
利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。

（3）检查凝胶的黏性和弹性。

思想感悟
经过这次酵母细胞的固定化实验，我不仅掌握了酵母细胞的固定化方法，同时也通过对注射器的使用，明白了固定化细胞时，针头应垂直于液面且保持较近的距离，同时注射时速度应相应提高，以保证自液面下落的固定化酵母直径较小，因为缓慢低价会导致在流出针头时，由于黏弹力会使液体聚集形成较大的液滴，而快速注射形成水流则会避免该现象。

实验二蛋白的酶解及水解度的测定
1．实验目的
通过本实验，要求掌握酶水解蛋白质和测定水解度的原理，并掌握蛋白质水解度的测定方法。

2．原理
（1）蛋白质酶水解.
蛋白质的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。

与酸碱催化的水解反应相比，它的反应条件温和，副反应少，水解效率高。

酶水解蛋白质主要受温度、pH值、加酶量、底物浓度及反应时间的影响。

根据不同的蛋白水解酶及底物情况，可设定不同的水解条件进行反应，作比较后，选择最佳的反应条件。

（2）水解度测定方法
当蛋白质中的肽键全部被水解生成氨基酸时，则水解度为100％，没有被水解时，其水解度为0。

由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就生成一个-NH2和一个-COOH基，因此，在测定蛋白质水解度时，只要定量的测定新生成的-NH2和-COOH基的量就可以计算出h值，这样就可以算出蛋白质的水解度。

常见的测定水解度的方法有甲醛固定法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(TNBS)、三氯乙酸法和pH-STAT法。

本试验采用茚三酮法测定蛋白质的水解度，其原理如下：
茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应生成氨，茚三酮、反应产物氨和还原性茚三酮共同反应，生成紫色化合物。

利用化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。

3.试剂和仪器设备
(1) 材料：地鳖酶解液
(2) 试剂：10％NaOH 溶液、标准L-亮氨酸（固体）、1％SDS溶液、0.2125M的磷酸缓冲溶
液（pH8.2）、茚三酮、KIO3、0.1N的HCl溶液、Arazyme蛋白酶(5000U/g)
(3) 仪器设备：粉碎机、磁力搅拌机，pH计、离心机、旋转式恒温振荡器、紫外可见分光
光度计、分析天平、电子秤、移液管（1mL、10mL）
4．实验步骤：
⑴试剂的配制
① 0.5mmol/L甘氨酸标准储备液制备：准确称取37.53mg甘氨酸定容至1000mL容量瓶中，于0℃条件下保存备用；甘氨酸标准使用液制备: 分别吸取上述溶液0.0、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0mL于试管中，用蒸馏水补足至1mL，相当于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L；
②碘酸钾KIO3稀释液制备：称取1.0g碘酸钾溶于蒸馏水中并稀释至300mL，再加入200mL95%乙醇溶液，混匀备用；
③茚三酮显色剂制备：称取0.5g茚三酮，用95%乙醇溶解并定容至100mL，此溶液在
低温条件下用棕色试剂瓶可保存两周。

④ pH 5.4，2mol/L醋酸缓冲液：A 2mol/L醋酸 20mL冰醋酸加入到173mL蒸馏水中，混匀；B 2mol/LNaAc 50gNaAc用305mL蒸馏水溶解，混匀；用A将B调节到pH 5.4。

⑵原料处理
选取干地鳖虫或榨油后的水分含量低，用粉碎机以60目过筛对原料进行粉碎。

⑶加水调酸：每次取粉碎好的原料5.0g放入250mL的三角瓶中，按料水比1：20加蒸馏水
到三角瓶中，将料液混匀。

用10％NaOH 溶液调节料液的pH 值到8.2，混匀。

⑷ 酶解：向已调pH 值的料液中加入Arazyme 蛋白酶0.3000g ，将三角瓶置入旋转式恒温振荡器内，在37℃、150r/min 进行酶解。

⑸ 灭酶：水解1小时后，取出三角瓶在80℃下灭酶15min 。

⑹ 离心分离：5000r/min 下离心10min ，倒出上清液即水解液，稀释20倍备用。

⑺ 水解度的测定：
①标准曲线的制定：取25mL 磨口具塞比色管6支，分别加入甘氨酸标准溶液1.0mL ，再向各管分别加入pH5.4 2mol/L 醋酸缓冲液，茚三酮显色剂各1.0mL ，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL ，摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min 后，取出，用冷水冷却15min ，再向各管中加入5.0mL KIO 3稀释液并摇匀，30min 后于570nm 测其吸光度。

标准曲线的绘制：
y=2.6409x-0.0544 R 2
=0.9322
② 测定水解液的水解度：取水解液1.0mL ，再向各管分别加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液，
浓度mg/L 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD 值
0.075
0.087
0.139
0.150
0.220
标准曲线
0.075
0.0870.139
0.150.22
R 2 = 0.9322
0.10.20.30.40.50.60
0.05
0.1
0.150.2
0.25
OD值
浓度m o l /L
系列1
线性 (系列1)
茚三酮显色剂各1.0mL ，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL 摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min 后，取出，用冷水冷却15min ，再向各管中加入5.0mLKIO 3稀释液并摇匀，30min 后于570nm 波长处测其吸光度。

5.实验数据及其处理
水解度（Degree of hydrolysis,DH ）是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为：DH= h / h tot ×100% 令x=0.563 y=1.43
H= =1.91mmol/g
h - 蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数（mmol/g ﹒蛋白质） h tot - 每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数（mmol/g ﹒蛋白质）
据实验结果表明，大豆蛋白（Soy protein ）, 酪蛋白（Casein ），明胶蛋白（gelatin ）中肽键的毫摩尔数各为7.75，8.0，11.1mequiv/g ，而花生蛋白或花生粕蛋白中肽键的毫摩尔数，到目前还没有实验结果的推荐值。

但是，利用一种底物进行酶解，选择最佳反应条件时，h tot 是固定不变的，产生变化的是根据不同反应条件下水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数。

所以，本实验可以用h 来表示蛋白质水解程度。

据测定，干地鳖虫蛋白质含量在60%以上，以60%计；花生粕的蛋白质含量为39.752%，计算时以40%来计算。

(参
考Adler-Nissen, Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzensulfonic acid ,1977)
6．问题讨论
⑴ 以花生粕作为水解原料的意义在哪里？
充分利用花生压榨制油后的资源，而且花生粕蛋白质营养价值高,含量高达40%.氨基酸配比合理，富含人体必须氨基酸。

⑵ 在国内食品加工中常用的蛋白质分解酶是什么？ 胃蛋白酶，凝乳酶，胰蛋白酶、组织蛋白酶
⑶ 从韩国引进的高效蛋白质分解酶Arazyme 的特点是什么？
Arazyme 酶是蜘蛛肠道中分离出的共生微生物所分泌的一种高效金属蛋白酶。

1*401*100310*43.13
-
特点：蛋白分解能力，更有效的分解动植物蛋白质，耐受高温，低温、较宽的PH范围；具
有一定的抗菌活性；有高效率的催化能力，具有高度专一性，作用条件较温和，生物效应是
瞬时的。

⑷本实验中的注意事项是什么？
1.实验中要用具塞比色管的目的是为了加热时确保安全。

2.使用醋酸缓冲液是为了给显色反应创造环境。

3.花生粕的蛋白质含量为39.752%，计算时以40%来计算
思想感悟
经过这次蛋白的酶解及水解度的测定实验，我不仅学到了酶水解蛋白质和测定水解度的原理，还学到了蛋白质水解度的测定方法。

蛋白的酶法水解就是利用蛋白水解酶催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。

而测定其水解度则需要依靠茚三酮法，生成的紫色化合物在570nm下测定的光密度，得出氨基酸的含量。

另外，绘制标准曲线时，为了获得更为准确的标准线，需要舍去误差较大的数据，为今后的实验数据处理积累了经验，而使用醋酸缓冲液创造显色环境也为提供了一定的参考。

实验三酶解物肽含量的测定
1.实验目的
随着对多肽生理功能认识的深入，多肽的提取及含量的测定也具有重要的意义。

本实验
主要目的是掌握利用BCA法测定肽含量的方法及原理。

2．实验原理
二价铜离子在碱性条件下可以被蛋白质分子中的肽键还原成一价铜离子，一价铜离子
和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。

两分子的BCA螯合一
个铜离子，形成紫色的反应复合物。

该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光
度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

3.试剂和仪器设备
（1）原料和试剂
原料：地鳖虫酶解物或花生粕酶解物，BCA蛋白质定量试剂盒，蒸馏水
试剂：①0.9% NaCl：称取2.25gNaCl，用蒸馏水定容至250mL；
②0.5mg/mL BSA标准液移取2.5mL 5mg/mL的BSA标准品，加入0.9%NaCl稀释至25mL，既得0.5mg/mL的BSA标准液；
③稀释酶液：取地鳖酶解液（工艺同实验三）加入，加入等体积的10%TCA混匀，静置10min，3000rpm离心15min，取上清液，稀释10倍，备用。

（2）仪器设备
恒温水浴锅、分光光度计、pH计、移液枪、分析天平、秒表或定时钟。

4.实验步骤：
（1）将试剂A摇匀，用10mL移液管移取10mL试剂A到小试剂瓶中，用移液枪向其中加
入200uL的试剂B（即试剂A与试剂B的量要满足A:B=50:1）,充分混匀。

BCA工作液在
室温24小时内稳定。

（2）取0.5mg/mL的BSA标准液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加0.9%NaCl补足1mL。

即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mLBSA标准液。

（3）取各标准液100uL，加入1mLBCA工作液，充分混匀，于37O C水浴中放置60min，取出
后在562nm波长下读其吸光值，做标准曲线。

（4）样品液测定：取3支试管，1号加入100uL蒸馏水，2、3号试管加入100 uL稀释后样
品，再向其中分别加入1mL BCA工作液，充分混匀。

将试管于37O C水浴中放置60min，取出
后在562nm波长下读其吸光值，根据标准曲线测定含量。

5.实验数据及处理
肽含量根据样品液的吸光值及BCA 的标准曲线计算。

标准曲线: 浓度mg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD 值 0.093
0.122
0.279
0.344
0.411
y=1.1218X+0.02 R 2
=0.9602
令X=0.596
则y=1.1218×0.596+0.02=0.689
6.问题讨论
（1）测定肽含量的意义在哪里？
多肽是由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物，测定其含量可以得知多
样品 2 3 平均 OD 值
0.613
0.579
0.596
标准曲线
0.0930.1220.279
0.3440.411
R 2
= 0.9607
0.10.20.30.40.50.60
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
OD值
浓度m g /m L
系列1
线性 (系列1)
肽的氨基酸种类及数量，从而分析其生理功能；
（2）BCA试剂混合时注意事项有哪些？
1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA
工作液，充分混匀。

2.BCA工作液室温24小时内稳定。

3.为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当的用微波炉加热，但是切勿过热。

附录：注意事项：
1、蛋白标准应在充分混匀后在稀释成不同浓度的标准液。

2、由于在做标准曲线时吸取量非常小，要注意移液枪加液的精确。

3、试剂A和试剂B混合成工作液时，可能会有混浊，但充分混匀后就会消失，成为淡蓝色的透明溶液。

4、BCA蛋白定量试剂盒受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保无EGTA，EDTA低于10mM，二硫苏糖醇低于1mM，B-基乙醇低于1mM。

不适用BCA法时建议使用Bradford法蛋白定量试剂盒。

还可以考虑用超纯水稀释，透析或除盐，ACETONE/TCA沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。

5、为了加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当的用微波炉加热，但是切勿过热。

6、如果发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，应考虑使用Bradford法蛋白定量试剂盒。

思想感悟
经过这次酶解物肽含量的测定实验，我学到了利用BCA法测定肽含量的方法。

从而也了解到，蛋白质作为人体的组成成分，作为人体必需的营养素之一，其强大功能的背后是氨基酸的多样性，本次实验测定肽含量就为了解分析蛋白质的功能特性提供了方法，同时，本次试验中使用了移液枪，也使我熟悉了移液枪的使用方法。

实验四、蛋白酶活力的测定（Folin-酚法）
1．实验目的
掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法。

2．原理
蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。

通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1微克酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。

3．主要仪器和试剂
（1）试剂和溶液
① 0.1mol/L HCl：取浓盐酸17mL，加水稀释并定容至100mL，即为2mol/L盐酸溶液；取100mL 2 mol/L盐酸溶液，定容2000mL，即为0.1mol/L盐酸溶液；
② 1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液
精确称取预先于105 o C干燥至恒重的L-酪氨酸0.5g，用适量盐酸溶解后，再用蒸馏水定容至500mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液；
L-酪氨酸标准使用溶液
吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.0 mL用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100 μg/mL L-酪氨酸标准液。

分别吸取100μg/mL L-酪氨酸标准液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成L-酪氨酸浓度分别为0、
10、20、30、40、50μg/mL的标准溶液。

③ 0.55mol/L NaCO3：称取29.2057g NaCO3定容至500mL容量瓶中；
④福林（Folin）试剂：使用时，以1份原Folin试剂与2份蒸馏水混匀，制成稀Folin 试剂；
⑤ PBS缓冲液（pH 7.6）：NaH2PO4溶液：准确称取0.6060g NaH2PO4,用蒸馏水定容至100mL，Na2HPO4溶液：准确称取1.7924gNa2HPO4,用蒸馏水定容至250mL；将NaH2PO4溶液缓慢滴入Na2HPO4溶液中用磁力搅拌器搅拌，用pH计测其pH值至7.6；
⑥ 1mol/L NaOH：准确称取2.0833g NaOH,用蒸馏水定容至50mL；
⑦ Casein溶液：称取1.21gCasein加入到PBS缓冲液160mL，在50-60o C水浴中搅拌，
加重蒸水定容至200mL ，用1N NaOH 调节溶液pH 至8.5；
⑧ 6M 醋酸：准确移取17.257mL 冰乙酸，重蒸水定容至50mL ；
⑨ TCA 溶液：TCA 1.8g ，无水醋酸钠1.8g ，6M 醋酸5.5mL ，重蒸水定容至100mL ； ⑩ 待测酶液的制备：称取1.0g Arazyme 酶溶于100mL 蒸馏水中，稀释100倍备用。

（2）仪器、设备
恒温水浴锅、分光光度计、pH 计、分析天平、秒表或定时钟。

4．实验步骤 （1）标准曲线绘制
按照表1分别吸取不同浓度的酪氨酸标准溶液、0.55mol/L 碳酸钠溶液和稀Folin 试剂于各管中，混匀。

将各管同时置于37o
C 水浴，反应30min ，取出，迅速冷却至室温，以空白管（0号管）为参比，在660nm 测吸光度。

以酪氨酸量为横座标，吸光度为纵座标，绘制标准曲线。

当吸光度为1时的酪氨酸量（μg ）即为比色常数K 值。

线性回归系数（r ）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。

对每个新配制的Folin 试剂制作新的标准曲线。

表1 酪氨酸标准曲线
2．样品的测定
取三支15×150mm 试管（一支空白管，二支样品管）。

分别向三支试管中准确加入5mL casein 基质液，将三支试管放入37o
C 水浴中预热5min ，分别向二支样品管加入1.0mL 稀释酶溶液，准确计时，反应30min ，取出。

迅速准确向三支试管中加入5mL TCA ，空白管先加TCA 再加稀释酶溶液，摇匀。

将三支试管继续置37o
C 水浴中放置30min ，取出，迅速冷却至
管 号
标准酪氨酸使用溶液
0.55mol/L 碳酸钠溶液(mL)
稀Folin 试剂
(mL) 浓度（μg/mL ）
吸取量（mL ）
0 0 2.0 5.0 1.0 1 10 2.0 5.0 1.0 2 20 2.0 5.0 1.0 3 30 2.0 5.0 1.0 4 40 2.0 5.0 1.0 5
50
2.0
5.0
1.0
室温。

三支试管中反应液用滤纸（Whatman4号滤纸）过滤。

另取三支15×150mm 的试管（一支空白，二支样品管）分别吸取上述相应的滤出液2.0mL ，0.55mol/L 碳酸钠溶液5.0mL ，稀Foiln 试剂1.0mL ，摇匀，置37o
C 水浴中放置30min ，取出，迅速冷却至室温。

以空白管（对照）调仪器零点，在分光光度计波长660nm 下，用比色皿，分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值。

通过查标准曲线或用线性回归方程求出生成的酪氨酸的含量。

标准曲线： 浓度μg/ml 10 20 30 40 50 O
D 值 0.142
0.290
0.461
0.581
0.729
R 2
=0.9976 Y=136.19x －0.004
5．实验数据及其处理 按照下式计算蛋白酶活力：
X 1(u/g)＝ A × K ×（11/2）×(1/10)×(1/W) ×N
=(136.19×0.039－0.004)×1/0.01×1/20×11/2×100 =1.4595×104
样品 样品1 样品2 平均值 OD 值
0.036
0.042
0.039
标准曲线
0.1420.29
0.461
0.5810.729
R 2
= 0.9976
01020304050600
0.2
0.40.6
0.8
OD值
浓度μg /m g
系列1
线性 (系列1)
式中：X1―蛋白酶活力，u/g；
A―样品与空白的的吸光度差
K―比色常数；
11―酶反应体系总体积（mL）；
2―参与反应的酶量（mL）；
N―酶样品稀释时的稀释倍数；
W―样品重量（g/mL）；
10―反应时间（min）。

6．思考题
（1）比色常数K的含义是什么？
当吸光度为1时的酪氨酸量（μg）
(2) 绘制标准曲线应注意哪几点？
1.仪器校验好，容器清洗干净
2.称量准确，所用标准品最好是新打开的，纯度较高的固体或溶液，防止污染
3.移液时迅速准确，尽可能用一根移液管
思想感悟
经过本次蛋白酶活力的测定的实验，我学到了用Folin-酚法测定蛋白酶活力。

蛋白质的水解产物氨基酸在碱性条件下，还原福林试剂并生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。

则在660nm下测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，从而计算出蛋白酶活力。

在反复的试验中，强化了对移液管和显色仪的使用。