组培实验步骤

组培实验步骤

1．量取液体。分别取上面八种母液10ml倒入一烧杯中，然后加蒸馏水至400 ml。（将用过的溶液及时放入冰箱，用完的容器要及时清洗）

2．称量蔗糖、琼脂。蔗糖30 g、琼脂7g。（称量的同时将电锅洗刷好、插好电源、倒入400 ml蒸馏水）3．熬制。将（1．）中配置好的溶液及（2．）中称好的物品均放入盛有400 ml蒸馏水的电锅中熬煮至沸腾，熬煮的同时要用玻璃棒不断搅拌。

4．定容。将熬制好的溶液倒入烧杯中加蒸馏水至1000 ml（实验室中烧杯加至红线处，速度要快）5．测PH值。用玻璃棒蘸取溶液抹到试纸上，后对比得出PH值。将PH值调制6.0（若大于6.0则加Hcl若小于6.0则加NaOH）。（速度要快，以妨培养基凉掉）

6．分装。将配好的培养基分装到洗净的培养瓶中。倒入高度因培养对象不同而异（月季枝条培养约2cm，胡萝卜愈伤组织培养约1 cm，但做生根培养要多加些）。（注：分装时，先把洗净的培养瓶横摆在实验台上一排，两人进行操作，一人倒溶液，一人紧随其后移瓶并盖盖。分装前要把培养基搅匀以防凝固效果不好。）

1000ml约分装13个瓶。

培养基参考：

增殖培养基：MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L

生根培养基：MS+ NAA0.2+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L

培养基配方是在不断实践摸索中，才能找到最适合的培养基。

二、无菌皿的制作。

将剪好的滤纸五张循环叠放，放入洗净的无菌皿中，后加蒸馏水将滤纸浸湿，盖好盖子，用干净的报纸包好。

三、无菌水的制作。

用蒸馏水把瓶子涮洗2~3次，后倒入2/3的蒸馏水，拧紧盖子。

四、高压灭菌。

将制作好的培养基、无菌皿、无菌水（接种时所需的工具也可用报纸包住放入锅内灭菌）放入高压灭菌锅中灭菌。

五、接种。

1．接种前准备工作。

（1．）首先将所需物品放入超净工作台内进行紫外灯照射杀菌30分钟。放入物品前先用酒精棉球将超净台台面擦一遍。所需物品：酒精灯（4个）、镊子(4把)、无菌皿、无菌水、酒精棉球溶液(2或4瓶)、大烧杯（1只，盛废液）、无菌皿、无菌水、培养瓶（每人至少一瓶）、次氯酸钠（浓度为5%的溶液）。放入的物品均药用酒精棉球擦拭消毒。超净台内在灭菌20~30分钟时开始通风（通风伴随整个接种过程）。（2．）洗、剪材料。将去过叶和刺的嫩月季枝条用洗涤剂清洗，后放入托盘中用清水冲洗干净。剪成的枝段约3 cm（枝段中间带有一个或两个芽，芽上方留的枝稍短，下方留的枝稍长），剪后直接放入一中等烧杯中。

2．接种操作。

（1．）人员进入。前门开开人员进去关上门后，再打开超净台实验室的门。

（2．）人员消毒。人员进入后，将超净台的门打开至1/3，把手伸进去用棉球擦消毒。

（3．）材料消毒。将盛有月季枝段的烧杯放入超净台内，先倒入一些70%的酒精消毒30秒，后用镊子拦住枝段，将酒精倒到盛废液烧杯中。再用浓度为5%的次氯酸钠（NaClO）消毒8分钟（若浓度为10%则只需消毒4分钟）。

（4．）洗涮材料。将盛月季枝段的烧杯中的次氯酸钠（NaClO）倒出，后倒入无菌水冲洗三次。（洗涮时要不断晃动烧杯）

（5．）打开无菌皿。（先用手将报纸去掉，再用两手的食指将盖子架起扣放到台面上，后将另一半盛有滤纸的皿放到前者的上面。）

（6．）镊子消毒。用酒精将镊子通体擦一遍，再蘸一下酒精，后在酒精灯上灼烧（除手捏的地方不烧，其余的均要烧，烧到烫为止。镊子用完都要放到盛酒精的瓶子中，且每次用时均要灼烧消毒）。

（7．）挑拣材料。将所需的月季枝段用镊子从烧杯中夹到无菌皿中的滤纸上。（可与对面的同学合作：一人将烧杯斜拿着，另一人将枝段夹出。切忌手在任何物品上漫过）

（8．）接种。先将培养瓶瓶盖拧开，后将培养瓶斜拿，在就酒精灯前稍灼烧瓶口，后用镊子夹住月季枝段插入培养瓶中（注意芽朝上，以免插倒），后将盖子拧紧（拧盖前要将盖子灼烧灭菌）。

（9．）将无菌皿中用过的滤纸用镊子捏出，放到超净台的一边。

（10．）清理台面。将台面用酒精棉球擦净，把用过的废弃物及不用的东西拿出超净台。（放在事先拿进去的蒸笼中，便于一起拿出）

（11．）关好超净台的门、紫外灯及通风按钮，后关掉总电源。

（12．）人员离开。离开时把蒸笼中的物品拿出实验室。（待人员均出来超净台实验室，实验室门关住后，再打开外面的门依次离开，最后将门关好）

六、做记录。

（1．）在培养瓶上贴上标签，在标签上写班级、姓名、日期。

（2．）清洗物品。将用过的器皿清洗后，放到架子上（无菌皿循环叠扣在托盘中）。把不用的药品及容器放到原来的位置。

（3．）做实验记录。把实验的时间、人员及其所做的工作做详细记录。

七、离开实验室。离开时将灯关掉，将所有电源切断。

注：一、工具的使用方法。

1．电子天平。

首先插好电源，然后按“开机”按钮，将纸放上后再按“去皮”按钮，最后进行称量。

2.高压蒸汽锅。

（1．）检查水位。先插好电源。若缺水灯及低水位灯亮则表明水不够，需加水至高水位灯亮。

（2．）将要灭菌的物品放入锅中蒸笼内，并详细各记录物品数量。

（3．）盖锅盖。将锅上的螺旋阀两两对齐，对拧，拧紧。

（4．）调整灭菌时间。时间调为20分钟（当压力达到1.1时才会倒计时），温度为121度（不必调）。（5．）取物品。待排气完，压力降至0时，开盖取物品。

二、实验时需做的其它事情。

刷洗培养瓶、无菌皿等实验过程中所需的、不洁净的器皿。剪滤纸及报纸。对镊子等接种工具消毒。三、实验用品。

1．实验材料：月季嫩枝条（颜色越绿越嫩）。

2．实验用具：烧杯、量筒、培养瓶、无菌皿、滤纸、PH试纸、滴管、高压灭菌锅、超净工作台、剪刀、电子天平、镊子、电锅、玻璃棒、酒精灯、水盆、刷子、干净报纸、打火机、水桶等。

3.所需液体。大量元素、微量元素、有机元素、铁盐、盐酸（Hcl）、氢氧化钠（NaOH）、2.4—D溶液、次氯酸钠（NaClO）、蒸馏水、无菌水、酒精、洗涤剂等。

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