碱性磷酸酶比活力测定ppt课件
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碱性磷酸酶的活力测定(修改版)

3.1 3.05 3.0 2.9 2.8 2.7
4、一般血清标本可以共用对照管,黄疸血清及溶血 1
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2
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伸文本框大小
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血清应分别作对照管
5、目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶,开后不能久 置
计算
• ALP活性=(A测定—A对照)/(A标准—A空白)*0.05*100(金 氏单位)
【注意事项】
1、 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的 作用。此液应避光保存,如出现蓝绿色即作废。
2、底物液中不应含有酚,如含有酚时空白管显红色, 说明磷酸苯二钠已开始分解,不宜继续使用。
3、加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终 单击编辑标题 单击此处编辑您要的内容,建议您在展示时采用微软雅黑字体, 止酶促反应)否则对实验结果有影响,偏大。 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑、改色、替换。 更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册。
细胞内酶
(一)血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶(CHE)、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• 它们大多数在肝内合成,在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。
• 血浆特异酶活性的改变,除了反映血液功能 外,还反映来源器官的功能。
(二)非血浆特异酶
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物,这种 方法又可分为:
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定(如本次实 验方法)。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色,如对 硝基苯磷酸二钠(PNPP)法。
• 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下,生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测 定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1

试剂(ml)
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min,各管进行A595测定 计算:样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度: 用比活性代表(单位重量蛋白质样品中 的活性单位) 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下,应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容
酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1.掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2.了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml,匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液)
A1:取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液,待测活性
A2:取0.1mlA液+4.9ml生理盐水,待测蛋白浓度
+2ml正丁醇,混匀2min,室温置30min,离心 (3000rpm)5min 下清液(吸取) 沉淀(弃)
蛋白含量计算 酶的总 活性 ( U) A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定PPT演示课件

蒸馏水
0.1
BCA试剂
1.5
/
标准管
/ 0.1 / 1.5
50 20
AB
0.1 0.1 // // 1.5 1.5
5
1
CD
0.1 0.1 // //
1.5 1.5
37保温 30分钟 562nm 比色
蛋白含量(mg/ml) =
A样 ×0.2 ×稀释倍数 A标
蛋白标准液浓度
19
计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性(U/mg) =
碱性磷酸酶的分离纯化
有机溶剂分步沉淀法
1
分离纯化的一般程序
选择材AKP溶于30%乙醇、33%丙酮(上清中), AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮(沉淀中),
3
操作
一、取材及匀浆
取兔肝2g,剪碎, 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液,充分 匀浆。 记录体积 (取0.1ml至一新EP管留作A液,测定时稀释25倍)
红色醌式化合物
16
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ) /
/
25 10 5
1
单位(ml)
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
/
/
酚标准液(0.1mg/ml) / 0.1
Tris-醋酸镁
0.1 /
复合底物液
3
3
0.1 0.1 0.1 0.1 //// //// 3 333
37保温 15分钟 各管加入铁氰化钾液2ml,静置15min
紫外分光光度计(200-400nm) 可见光分光光度计(400-760nm) 红外分光光度计(760-1000nm)
9
2、 定量分析的理论基础 --Lambert—Beer定律
实验碱性磷酸酶比活力测定

管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 (min)
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 (min)
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH,后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中,但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。
实验 碱性磷酸酶比活力测定
实验目的
掌握酶活性测定方法的一般原理方法
测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力
实验原理
酶活力:即是酶活性,是表示催化某一特定反应的
能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学 反应速度表示。 酶催化的反应速度越快,酶活性越高,反之则愈低。 底物减少量或生成物增加量
6
0.6 0.2
碱性磷酸酶的活力测定 ppt课件

(2)各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生,故骨骼 病特别是有新生骨质生成时,血液内ALP活性增加,以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低:主要见于呆小症,磷酸酶过少症等。
PPT课件
12
•问题2:
• 如何测定酶活性?
PPT课件
8
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS PPT课件
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
9
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
血清碱性磷酸酶活性测定 (磷酸苯二钠法)
PPT课件
1
• 问题1:
• 为何要测定血清中酶的活性?有什 么意义?
PPT课件
2
引言(1)
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 降低:主要见于呆小症,磷酸酶过少症等。
PPT课件
12
•问题2:
• 如何测定酶活性?
PPT课件
8
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS PPT课件
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
9
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
血清碱性磷酸酶活性测定 (磷酸苯二钠法)
PPT课件
1
• 问题1:
• 为何要测定血清中酶的活性?有什 么意义?
PPT课件
2
引言(1)
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
碱性磷酸酶的活力测定(修改版)

整理版ppt
32
肆 · 实验操作
整理版ppt
33
实验过程两次水浴保温,一次5min,一次15min。前者 是达到最适温度,后者是反应时间
取试管4支,按下表操作
• 立即混匀。用510nm波长(红色醌物质的最大吸收波长)比色,以蒸馏水 调零点,读取各管吸光度。
•保持反应时温度是均衡的,37°C整理版ppt
• 连续监测法: (速率法)
• 连续监测法是指每隔一定时间(2~60s),连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法。
• 适用于自动生化分析仪
• 能动态观测酶促反应进程,结果准确可靠,标本和试剂 用量少,可在较短时间内完成测定。
整理版ppt
28
磷酸苯二钠法
• 在pH10环境中,ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二 钠。
• 苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化 生成醌衍生物。
• 可根据红色深浅测定酶活性的大小。
磷酸苯二钠+H2O (ALP, PH=10) → 苯酚 + 磷酸氢二钠
4-氨基安替比林(铁氰化钾整)理版+p苯pt 酚 → 红色醌亚胺衍生物 29
• ALP几乎存在于机体各个组织,但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多,儿童期含量尤其多。
• ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自 肝脏, AKP3来自骨细胞,AKP4产生于胎盘及癌细胞 ,而AKP5来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
• • 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的
叁 · 实验器材与试剂
整理版ppt
30
• (一)器材:
碱性磷酸酶的检测与临床应用(共31张PPT)

• 我国曾应用较广的为磷酸苯二钠比色法,但现 碱性磷酸酶高对人体的影响
(3)其他疾病如甲状旁腺机能亢进。
在应用较多的是连续检测法。原理为以磷酸对 各种类型的骨质疏松,良性成骨细胞瘤等ALP无明显变化。
碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查?它主要经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道 胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。
肝胆疾病引起的ALP升高
• 肝细胞参与合成ALP,肝胆疾病时增高的ALP来 自肝细胞。
淤胆性疾病时ALP的升高
• ALP存在于毛细胆管面的微绒毛上,在胆汁分 泌障碍时明显增高。因胆汁酸刺激而ALP mRNA转译增高,肝细胞合成ALP亦增高。ALP 经胆汁排出,肝内外胆管阻塞时,ALP有非常 明显的升高,ALP升高先于黄疸的出现,在黄 疸消退后还可持续异常。在原发性胆汁肝硬化 、药物性肝炎、肝移植排斥或淤胆型病毒性肝 炎引起的肝内淤胆,都会使ALP升高,甚至高 达正常值的4倍。
入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反 而除来源于肠和胎盘外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制;
(1)骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等;
流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。碱性 根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。
所以恶性肿瘤患者血清肝型和骨型都增高的比例较大,定量测定肝型与骨型ALP同工酶,对判断肿瘤的扩散和疗效均具有重要价值。 较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性;
• 单乙醇胺对碱性磷酸酶有温度依赖的抑制作用 ;
• 较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶 的活性;
• EDTA通过络合碱性磷酸酶而导致该酶活性中心 微环境构象发生变化,从而不可逆地抑制碱性 磷酸酶的活性;
(3)其他疾病如甲状旁腺机能亢进。
在应用较多的是连续检测法。原理为以磷酸对 各种类型的骨质疏松,良性成骨细胞瘤等ALP无明显变化。
碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查?它主要经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道 胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。
肝胆疾病引起的ALP升高
• 肝细胞参与合成ALP,肝胆疾病时增高的ALP来 自肝细胞。
淤胆性疾病时ALP的升高
• ALP存在于毛细胆管面的微绒毛上,在胆汁分 泌障碍时明显增高。因胆汁酸刺激而ALP mRNA转译增高,肝细胞合成ALP亦增高。ALP 经胆汁排出,肝内外胆管阻塞时,ALP有非常 明显的升高,ALP升高先于黄疸的出现,在黄 疸消退后还可持续异常。在原发性胆汁肝硬化 、药物性肝炎、肝移植排斥或淤胆型病毒性肝 炎引起的肝内淤胆,都会使ALP升高,甚至高 达正常值的4倍。
入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反 而除来源于肠和胎盘外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制;
(1)骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等;
流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。碱性 根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。
所以恶性肿瘤患者血清肝型和骨型都增高的比例较大,定量测定肝型与骨型ALP同工酶,对判断肿瘤的扩散和疗效均具有重要价值。 较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性;
• 单乙醇胺对碱性磷酸酶有温度依赖的抑制作用 ;
• 较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶 的活性;
• EDTA通过络合碱性磷酸酶而导致该酶活性中心 微环境构象发生变化,从而不可逆地抑制碱性 磷酸酶的活性;
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定26页PPT

可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合,使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
米氏常数的求法
1
V
=
Km Vmax
×
1 [S]
+
1
Vmax
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km个相当重要的 常数,通过实验,可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶
酚 Na2HPO4
pH=10.0,
37℃ OH-(磷酚钼试钨剂酸)
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐 标,按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1.酚试剂 2.2.5mmol/L磷酸苯二钠基质液 3.碱性缓冲液(pH-10.0) 4.碱性磷酸酶液
混匀后,37℃水浴15min,以第8管调节零点,
在650nm波长处进行比色,读取各管A值。
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7
A650
1/A650 [S]
1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作
碱性磷酸酶的活力测定(修改版)

血清碱性磷酸酶活性测定 (磷酸苯二钠法)
• 问题1:
• 为何要测定血清中酶的活性?有什
么意义?
引言(1)
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。 • 用于诊断的酶类已超过100多种,常用的数十 种。
血浆酶的来源
血浆特异酶 血浆酶 非血浆特异酶 细胞内酶 外分泌酶
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物,这种 方法又可分为:
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定(如本次实 验方法)。 • 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色,如对 硝基苯磷酸二钠(PNPP)法。 • 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下,生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测 定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
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计算
• ALP活性=(A测定—A对照)/(A标准—A空白)*0.05*100(金 氏单位) • 金氏单位定义
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
• ALP几乎存在于机体各个组织,但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多,儿童期含量尤其多。 • • • ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自 肝脏, AKP3来自骨细胞,AKP4产生于胎盘及癌细胞 ,而AKP5来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的 诊断。
• 问题1:
• 为何要测定血清中酶的活性?有什
么意义?
引言(1)
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。 • 用于诊断的酶类已超过100多种,常用的数十 种。
血浆酶的来源
血浆特异酶 血浆酶 非血浆特异酶 细胞内酶 外分泌酶
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物,这种 方法又可分为:
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定(如本次实 验方法)。 • 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色,如对 硝基苯磷酸二钠(PNPP)法。 • 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下,生成在 405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测 定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性。
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计算
• ALP活性=(A测定—A对照)/(A标准—A空白)*0.05*100(金 氏单位) • 金氏单位定义
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
• ALP几乎存在于机体各个组织,但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多,儿童期含量尤其多。 • • • ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自 肝脏, AKP3来自骨细胞,AKP4产生于胎盘及癌细胞 ,而AKP5来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的 诊断。
实验三枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶ppt课件

悄然吹打菌体使其悬浮于上述溶液中,37度振荡20min,5000rpm离心15min,
上清液即为粗酶液。留取1mL粗酶液做酶活测定。
分级盐析
50%饱和度除杂蛋白:向其他粗酶液〔约7mL〕中渐渐参与研细的硫酸铵粉末至 50%饱和度〔边加边搅拌至硫酸铵溶解〕,室温下静置10min,5000rpm离心 15min,弃沉淀;
生物技术综合实验
南京师范大学生命科学学院 张茵
2021.3
实验三、枯草芽孢杆菌 碱性磷酸酶的提取和酶活测定
实验目的
学习盐析法提取碱性磷酸酶; 学习透析法脱盐;
实验资料
菌种:枯草芽孢杆菌; 培育基:Tris培育基; 试剂:0.1M Tris-HCl缓冲液〔pH7.5〕, 1M MgCl2溶液, 硫酸铵固体粉末, 0.1M Tris-HCl缓冲液〔pH9.5〕,40mM NPP溶液; 仪器:离心机、水浴锅; 其它资料:透析袋〔14000Da〕。
实验原理
浸透压冲击法破裂细胞; 分级盐析法提取碱性磷酸酶; 透析法脱盐; 酶活测定的原理。
浸透压冲击法破壁
原理: 碱性磷酸酶前体普通存在于外周胞质中,在跨膜分 泌的过程中加工为成熟的碱性磷酸酶,故成熟的碱性磷酸酶 为存在于质膜上的一种膜结合蛋白。
因此本实验采用浸透压冲击法抽提碱性磷酸酶,在高
优点:简便、较少引起蛋白量变性;
缺陷: ① 在盐析过程中,蛋白质的溶解度猛烈下降,易产生共沉景象,
故分辨率不高;
② 盐析后需进展脱盐步骤。
影响要素:① 蛋白质浓度普通控制在2%~3%;
② pH值普通选择在蛋白质的等电点附近;
③ 在高盐下,蛋白质的溶解度普通随温度的升高而降低,
透析法
原理:在常压下,依托小分子物质的分散运动将 两类分子量差别较大的物质别分开来。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定 ppt课件

a. 低温条件下操作 b. 所有试管均需洗干净 c. 选择合适的pH及合适的缓冲体系,以稳
定酶活性
保护和稳定AKP
Mg(Ac)2 ~ NaAc 混合液提取AKP pH 8.8 Tris 缓冲液测AKP活性
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
14
活性测定
三、操作步骤
2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管
加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液2ml ,匀浆
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法;
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算;
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
4
活性测定
二、实验原理
1、 AKP概述
① 催化有机单磷酸酯水解,并有转移磷酸基的作用 ②最适pH:8.6~10.3 ③ 特点:特异性低
AKP比活性(U/mg)=
每ml制剂中蛋白质含量(mg)
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
27
活性测定
2、得率
每一制剂中总的酶活性单位
得率 =
其比
28
活性测定
3、纯化倍数
每一制剂AKP比活性(U/mg)
纯化倍数 =
溶液A制剂AKP比活性(U/mg)
30
活性测定
有机溶剂体积的计算——96%乙醇
VB/中加乙醇96%
30%
(VB/ + VX)× 30% = 96% × VX
VX = 0.45 VB/
VB/ /中加乙醇(96% )从30%
60%
(VB/ / + VX)× 60% - VB/ / × 30% = 96% × VX
定酶活性
保护和稳定AKP
Mg(Ac)2 ~ NaAc 混合液提取AKP pH 8.8 Tris 缓冲液测AKP活性
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
14
活性测定
三、操作步骤
2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管
加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液2ml ,匀浆
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法;
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算;
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
4
活性测定
二、实验原理
1、 AKP概述
① 催化有机单磷酸酯水解,并有转移磷酸基的作用 ②最适pH:8.6~10.3 ③ 特点:特异性低
AKP比活性(U/mg)=
每ml制剂中蛋白质含量(mg)
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
27
活性测定
2、得率
每一制剂中总的酶活性单位
得率 =
其比
28
活性测定
3、纯化倍数
每一制剂AKP比活性(U/mg)
纯化倍数 =
溶液A制剂AKP比活性(U/mg)
30
活性测定
有机溶剂体积的计算——96%乙醇
VB/中加乙醇96%
30%
(VB/ + VX)× 30% = 96% × VX
VX = 0.45 VB/
VB/ /中加乙醇(96% )从30%
60%
(VB/ / + VX)× 60% - VB/ / × 30% = 96% × VX
酶活力及酶课件.ppt

非竞争性抑制作用
E+S
ES
+
+
I
I
P+ E
EI+S
ESI
实例:重金属离子(Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+) 金属络合剂(EDTA、F-、CN-、N3-)
非竞争性抑制特点: 1)抑制剂与底物结构不相似,抑制剂与酶活性
中心以外的基团结合。 2)Vm下降,Km不变 3)非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法
0
6
8
10 pH
最 适 pH
酶的最适pH也不是一个固定的常数,它受到 底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度; 酶的纯 度;反应的温度、时间等的影响。
例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时
[s]为2.5x10-5 M,最适pH为 8.3 [s]为2.5x10-2 M,最适pH为10.0
pH影响反应速度的原因
抑制剂类型和特点
不可逆抑制剂
非专一性不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂
可逆抑制剂
竞争性抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂
抑制作用的类型:
(一)不可逆抑制作用:
抑制剂与酶反应中心的
活性基团以共价形式结
合,引起酶的永久性失
活。如有机磷毒剂二异
丙基氟磷酸酯。
抑制胆碱酯酶活性, 使乙酰胆碱不能被分解成 乙酸和胆碱,引起乙酰胆 碱的积累,使神经处于过 渡兴奋状态,因此此类化 合物又称神经毒气。
2. 有机分子
还原剂:抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂:EDTA 激活酶原的酶
6)、抑制剂对酶活性的影响
使酶的活性降低或丧失的现象,称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。抑 制剂并非变性剂,抑制剂具有不同程度的选择性。
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0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 40.3 溶解透析上清液
DEAE-32酶液
9.6 3.82
Sephadex G75酶液 13.2 0.49
35.3 314.7
1002. 2
451.5
Sephadex G200酶液 6.8 0.21
509.3
14
注意事项
1. 取液量一定要准确。 2. 反应时间一定要精确。 3. 加酶前后一定要将试剂混匀。 4. 空白对照一定要先加NaOH,后加酶。 5. 移液管或微量移液器的使用 6. 比色杯的使用 7. 三步样品一定要完全化冻才能进行测定 8. 水浴
15
管号 1 1' 2 2 ' 3 3 ' 4 4 ' 5 5 '
加酶时 0.5
红色醌亚胺衍生
物
9
操作方法
1 对硝基苯酚标准曲线的制作(不做): 取15支试管编号,0号一支,1-7号各二支,按下列表格操作。
管号
01 2 34567
pNP含量 (mol)
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
得率%=各步总活力*100/第一步总活力
13
将测定的数据或计算结果用下表记录。(此为例子)
步骤 匀浆过滤液
总体 蛋白 总蛋 酶活 总活 比活mg U/mL U
力 化率
U/mg
倍 数
%
400 7.24
20.3
正丁醇处理上清液 470
33.8
0.35饱和(NH4)2SO4上 440 清液
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL)
各管加入0.2 mL
0.1 mol/L NaOH (mL)
各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标,OD405nm值为纵坐标,绘制标准曲
8
磷酸苯二钠法
在pH10 环境中,ALPase催化磷酸苯二钠水解生 成苯酚和磷酸氢二钠,苯酚与4-氨基安替比林反
应生成色素原,该色素原经铁氰化钾氧化生成红
色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计
算酶活性的大小。 碱性磷酸酶
反应式如下: 磷酸苯二钠+H2O
苯酚+磷酸氢二钠
苯酚+4-氨基安替比林
1.终止测定法(终点法) 终止测定法是在酶和底物反应达到预定的时间时,
立即加入终止剂使酶变性,终止酶促反应,在这段 反应时间里面,产物的生成量基本成线性增加,用 这段反应时间内的平均速率代替反应初速率。 2.动力学分析法(连续监测法或速率法)
5
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase ,简称 为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解 反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。 它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸 基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受 体上。
反应式:pNPP+H2O 碱性磷酸酶 pNP+HPO42-
无色
黄色
可通过分光光度法测定产物pNP的含量,求出反应速度v。
7
酶活力单位定义为:在37℃下,以0.5 mmol/L pNPP为 底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测 活体系中每分钟催化产生1 mol pNP的酶量定为1个酶 活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活 力单位数。
线。求出pNP的克分子消光系数()值。
=8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1
10
2 酶活力的测定
管号
空白
1
2
3
5 mM pNPP(mL)
各0.2mL
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL
本实验采用双缩脲法测定蛋白浓度。
分离提取的三步酶制剂按一定比例用TrisHCl缓冲液稀释,稀释倍数视溶液的蛋白浓 度高低而定。(一般稀释5-10倍)。
12
计算4 结:果处理
酶活力(U/mL) = B t V1
蛋白浓度(mg/mL)= C A V2
式中:A为稀释倍数,B为由标准曲线查得的pNP mol数或
底物减少量或生成物增加量 单位时间
3
产物浓度
a
v=a/b
b
酶促反应进程曲线
反应时间
要真实反映出酶活力的大小,就应该在产物生成量与 酶反应时间成正比的这一段时间内进行初速度的测定。
活力测定中应注意的几个问题
(1) 活力测定一般测定产物增加速度为好。
(2) 测活过程应注意外界环境的影响。
4
方法:
者通过=8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1换算
(B=4000×OD405/),t为反应时间,C为由标准曲线查得的蛋 白mg数,V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定蛋白浓 度所用的酶量(mL数)
酶的比活力(U/mg)=
酶活力(U/mL)
蛋白浓度(mg/mL)
纯化倍数=各步比活力/第一步比活力
6
对-硝基苯磷酸二钠法
碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解反应,以
对-硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在pH10.1的碳酸
盐缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催
化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚(pNP)的量。产物
pNP在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD405 nm 值 的增加计算酶活力的大小。
各0.50mL 混匀,37℃,5分钟
酶液(mL)
/
各0.1mL
37℃,精确反应10分钟
0.2 mol/L NaOH (mL)
各管加入2.0 mL
酶液(mL)
0.1mL
OD 405 nm
以0号管调零点,测定各管的OD405nm值,从对照标准曲线求出产
物的mol数,算出酶活力。
11
3 蛋白浓度的测定
实验 碱性磷酸酶比活力测定
1
实验目的
掌握酶活性测定方法的一般原理方法 测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力
2
实验原理
酶活力:即是酶活性,是表示催化某一特定反应 的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定 化学速度表示。
酶催化反应速度越快,酶活性越高,反之则愈低。
酶促反应速度v =
DEAE-32酶液
9.6 3.82
Sephadex G75酶液 13.2 0.49
35.3 314.7
1002. 2
451.5
Sephadex G200酶液 6.8 0.21
509.3
14
注意事项
1. 取液量一定要准确。 2. 反应时间一定要精确。 3. 加酶前后一定要将试剂混匀。 4. 空白对照一定要先加NaOH,后加酶。 5. 移液管或微量移液器的使用 6. 比色杯的使用 7. 三步样品一定要完全化冻才能进行测定 8. 水浴
15
管号 1 1' 2 2 ' 3 3 ' 4 4 ' 5 5 '
加酶时 0.5
红色醌亚胺衍生
物
9
操作方法
1 对硝基苯酚标准曲线的制作(不做): 取15支试管编号,0号一支,1-7号各二支,按下列表格操作。
管号
01 2 34567
pNP含量 (mol)
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
得率%=各步总活力*100/第一步总活力
13
将测定的数据或计算结果用下表记录。(此为例子)
步骤 匀浆过滤液
总体 蛋白 总蛋 酶活 总活 比活mg U/mL U
力 化率
U/mg
倍 数
%
400 7.24
20.3
正丁醇处理上清液 470
33.8
0.35饱和(NH4)2SO4上 440 清液
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
各管加入1.0 mL
20 mmol/L MgCl2 (mL)
各管加入0.2 mL
0.1 mol/L NaOH (mL)
各管加入2.0 mL
OD 405 nm
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标,OD405nm值为纵坐标,绘制标准曲
8
磷酸苯二钠法
在pH10 环境中,ALPase催化磷酸苯二钠水解生 成苯酚和磷酸氢二钠,苯酚与4-氨基安替比林反
应生成色素原,该色素原经铁氰化钾氧化生成红
色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计
算酶活性的大小。 碱性磷酸酶
反应式如下: 磷酸苯二钠+H2O
苯酚+磷酸氢二钠
苯酚+4-氨基安替比林
1.终止测定法(终点法) 终止测定法是在酶和底物反应达到预定的时间时,
立即加入终止剂使酶变性,终止酶促反应,在这段 反应时间里面,产物的生成量基本成线性增加,用 这段反应时间内的平均速率代替反应初速率。 2.动力学分析法(连续监测法或速率法)
5
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase ,简称 为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解 反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。 它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸 基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受 体上。
反应式:pNPP+H2O 碱性磷酸酶 pNP+HPO42-
无色
黄色
可通过分光光度法测定产物pNP的含量,求出反应速度v。
7
酶活力单位定义为:在37℃下,以0.5 mmol/L pNPP为 底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测 活体系中每分钟催化产生1 mol pNP的酶量定为1个酶 活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活 力单位数。
线。求出pNP的克分子消光系数()值。
=8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1
10
2 酶活力的测定
管号
空白
1
2
3
5 mM pNPP(mL)
各0.2mL
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL
本实验采用双缩脲法测定蛋白浓度。
分离提取的三步酶制剂按一定比例用TrisHCl缓冲液稀释,稀释倍数视溶液的蛋白浓 度高低而定。(一般稀释5-10倍)。
12
计算4 结:果处理
酶活力(U/mL) = B t V1
蛋白浓度(mg/mL)= C A V2
式中:A为稀释倍数,B为由标准曲线查得的pNP mol数或
底物减少量或生成物增加量 单位时间
3
产物浓度
a
v=a/b
b
酶促反应进程曲线
反应时间
要真实反映出酶活力的大小,就应该在产物生成量与 酶反应时间成正比的这一段时间内进行初速度的测定。
活力测定中应注意的几个问题
(1) 活力测定一般测定产物增加速度为好。
(2) 测活过程应注意外界环境的影响。
4
方法:
者通过=8.80×103( mol/L)-1﹒cm-1换算
(B=4000×OD405/),t为反应时间,C为由标准曲线查得的蛋 白mg数,V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定蛋白浓 度所用的酶量(mL数)
酶的比活力(U/mg)=
酶活力(U/mL)
蛋白浓度(mg/mL)
纯化倍数=各步比活力/第一步比活力
6
对-硝基苯磷酸二钠法
碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解反应,以
对-硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在pH10.1的碳酸
盐缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催
化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚(pNP)的量。产物
pNP在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD405 nm 值 的增加计算酶活力的大小。
各0.50mL 混匀,37℃,5分钟
酶液(mL)
/
各0.1mL
37℃,精确反应10分钟
0.2 mol/L NaOH (mL)
各管加入2.0 mL
酶液(mL)
0.1mL
OD 405 nm
以0号管调零点,测定各管的OD405nm值,从对照标准曲线求出产
物的mol数,算出酶活力。
11
3 蛋白浓度的测定
实验 碱性磷酸酶比活力测定
1
实验目的
掌握酶活性测定方法的一般原理方法 测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力
2
实验原理
酶活力:即是酶活性,是表示催化某一特定反应 的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定 化学速度表示。
酶催化反应速度越快,酶活性越高,反之则愈低。
酶促反应速度v =