药物动力学实验方法概述

第一部分 实验设计
1－1．动物选择 除了临床药代在人体进行外，其余可选用大 鼠、小鼠、兔、狗、猴等动物进行试验。药代过 程的种属差异很大，动物试验结果与人体结果往 往不同。 一般常常采用大鼠，一是它易于操作，可多时 间点取血，二是它的代谢特点与人相似。有时采 用小鼠，它易于操作，用药量少，但血量少，一 般只能单时间点取血。兔可多时间点取血，但用 药量大一些，且因有反刍作用而不适用于口服 药。狗可多时间点取血，但用药量大，且饲养和 操作比较复杂一些。
药物代谢动力学
药物代谢动力学（pharmacokinetics），也称药 代动力学或药物动力学。是数学与药理学相结合 产生的一门学科。药物进入机体后，在血液中的 含量会随着时间的推移而变化，是一个动力学过 程。药代动力学是假设药物进入机体后有不同的 分布空间，每个空间作为一个房室。每种情况用 对应的数学公式表达，称为数学模型。将实验测 得的数据用不同的房室模型模拟，选择相关性最 好的，可以得到有关的参数。
3-1-1-1．血样采集的基本原则
（1）次数，静注不少于9个时间点，口服不少于11 个时间点，时间应达到3－5个半衰期。 （2）体积，根据实验需要和分析方法的灵敏度，一 般每次采0.5~5ml；动物实验时，采血量不宜超 过动物总血量的十分之一，以免因血流动力学的 变化而影响实验结果。 （3）方式，尽可能从同一动物连续采取血样。小动 物血量少，无法做到这一点，则可用几只动物合 并的方法。
2－2－3．固相提取（液一固提取）
溶剂提取的缺点：乳化，体积大，易带入杂 质，费时，操作麻烦，不易自动化等。 固相提取的概念：用吸附剂（填充于柱内或悬 浮于溶剂中）在一定pH下从生物样品中选择性吸附 药物，再用有机溶剂将其洗脱。 优点：1、不发生乳化；2、适应的极性范围较 广；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶剂用量 少；6、易于自动化。 目前，商品化固相提取小柱（cartridge）的应 用已比较普遍。
3-1-1-2．血样的种类 血浆（plasma）：加抗凝剂后离心分出 的黄色上清液，约为全血量的50％。 血清（serum）： 血液不加抗凝剂，待 发生凝固后，离心分离出的黄色上清液， 约为全血量的30－40％。 全血：加抗凝剂后不分离。
1－3－2 尿样 优点： 容易获得，属非损伤性取样，且样品量 大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是 研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不 需去蛋白处理。 缺点： 与血药浓度不相关，难以反应药物作用 过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样， 易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的 化合物就达数十种，致使样品处理较困难。 尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。。
药物动力学 实验方法概述
1． 药物代谢的定义和意义 定义
药物代谢是研究药物在体内吸收、 分布、代谢、排泄过程的科学，简言 之，即是研究药物的体内过程规律的 一门科学。
意义
药物代谢研究描述药物在动物体内的过 程，可以作为药效学和毒理学研究的借 鉴，也可以在适应症、用药途径、剂型、 剂量、给药间隔等方面为临床应用提供依 据。药物代谢研究结果已经成为申报临床 研究必须提交的重要资料。并且，因其是 新药开发中半途淘汰的主要原因之一，很 多大型医药公司已将药物代谢作为早期筛 选的内容。
1－3－4组织匀浆 用于动物，研究药物的组织分布情况。 应取全部主要脏器和组织，尤其对重要器 官，如心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、 生殖器官，骨胳肌、脂肪、皮肤等。 其它样品还有胆汁、粪便、乳汁、脑脊 液、汗液、呼出的气体等。
1－4 生物样品的贮存
采样后除立即分析外，为防止药物发生变化。 一般可在－20C冷冻，也有人采用－40～－80C。 有时，还应考虑加入稳定剂： 酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖 胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，则应在采样 后立即加入酶抑制剂如氟化钠等。 抗氧化剂：一些易氧化的药物，可加入维生素C 或其它抗氧化剂。如血浆中儿茶酚类药物常规保存 仅4周，若加入适量VC，则能保存10周。 另外，还需注意避免同一份样品反复多次冻 融。对需多次取样分析的样品宜分装成若干小分冻 藏。
1－3．取样 药动学研究中的样品主要有体液、器官、 组织以及排泄物等。 血液是最常用的样品。动物和人均可采 集，可选用多个时间点。 器官、组织只适用于动物。一只动物只能 选用一个时间点。 粪、尿，动物和人均适用，只能以时间段 采集，有时会有收集不到的情况。
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1－3－1 血样 对于动力学研究，一般采集人和动物静 脉血。血样的优点是采集方法较简单，可 以在活体上进行，多时间点取样，由于血 内含量与体内药物总量平行，因而与药效 学密切相关。
2-3 生物样品的净化
1、液-液回提（多次提取） 对于碱酸性药物，在有机溶剂初次提取后，调 节适当的pH值，使药物变成离子型，用水把药物回 提到水相：然后调节水相pH，使药物变成分子型， 再用有机溶剂萃取水相中的药物。一些酸碱性杂 质，可用此法除去。 2、薄层层析： 样品被提取后，进行薄层层析，经显色定位， 把药物所在的斑点刮下来，洗脱后定量或定性。 薄层上的中斑点有可能是一个混合物，常采用不同 的展开剂多次或双向展开以确定之。
第二部分 样品处理
生物样品的特点： 1) 样品成分复杂：除了待测物及其代谢物外，尚有各种内 源性杂质，如蛋白、激素、维生素、脂质、胆汁成分、电 解质以及可能存在的其他药物和代谢物。 2) 样品量少且不可重复获得。 3) 被测物含量很低，通常在ug/ml级以下。 4) 药物浓度随取样时间而变化，有时前后相差10-100倍， 给测定带来一定困难。 5) 代谢产物与原形药分子结构相近，分离较困难。
提取原理： 药物在疏水的有机溶剂和水相之间进行分配，大多数药物脂溶性较 强，在有机溶剂中分配较多。 理想的提取溶剂： ①对被测物有较好的溶解性，但相互不发生反应。 ②与水相不混溶，且密度差别明显，振摇混匀后易分层，不易乳化。 ③沸点合适（太低，太高均不合适），易挥发除去。 ④纯度较好（一般取分析纯），无紫外吸收，不会使液闪计数淬灭。 ⑤价格便宜，毒性低，安全（不易燃易爆） 在常用溶剂中，乙酸乙酯安全无毒，对不同极性的被测组分有较高的 萃取回收率，易于挥干，提取物中内源性杂质少，是较理想的首选溶 剂。
2－2－2．离子对提取
一些电离性较强的药物在水溶液中主要 以电离形式存在，很难被提取，此时，若加 适当的反离子（counter ion ）与其形成离子 对（大分子复合物），则成为一种伪中性分 子，能从水相进入有机相中。 常用的反离子有：季铵盐 R4N+（阳离 子）；苦味酸 C6H3（NO2）3O-有机磺酸盐 CH3- -SO3-（阴离子）；常用的提取溶剂为 卤代烃类，如CH2Cl2
1－2．给药 给药途径：新药研究应与临床给药途径一 致。而做绝对生物利用度研究时，则必须 加上采用静脉给药途径。 动物实验采用口服途径时应注意事先禁 食，避免食物影响药物吸收；虽然临床上 不用腹腔给药，但动物实验可采用。因为 其吸收较快，影响因素不象口服那样多。
剂量：一般采用三个剂量，其中一个与治疗 剂量一致，观察血药时程以及剂量与血药 浓度是否呈正相关关系，其中高剂量采用 剂量较大，目的是观察大剂量下是否存在 药物的饱和。 一般先做预实验，以确定剂 量范围。
缀合物有两种形式： 1）葡萄糖醛酸甙：含OH, COOH, NH2, SH基的药物分子； 2）硫酸酯：含酚，芳香胺等的药物分子。 缀合物极性大，不易被有机溶剂提出，需先水解使药物释 出。 1）酸水解：0.1N HCl，100℃, 30min, 条件较剧烈，易致药 物分解，空白值也高。 2）酶水解：葡萄糖醛酸酶（glucuronidase）或硫酸酯酶, 也可用二者的混和物。一般在pH4.5-7，37℃数小时，条件 温和，选择性强，但费用较高。
2－1－2 组织样品的消化
对于与组织结合很牢的药物，采用沉淀蛋白的 处理难以使药物充分释放出来，此时可将组织消 化。 剧烈的条件：如NaOH溶液，甲酸－双氧水 等；这种处理也可能导致药物的破坏，一般适用于 放射性同位素标记药物的实验。 温和的条件：常用蛋白水解酶使肽键降解。
2－1－3 缀合物的水解
历史
药物代谢的研究始于何时还没有一个非 常权威的考证，可能要追溯到二十世纪四 十年代或更早，当时这方面的论文甚少， 直至六十年代，研究论文的数量才陡然增 加。其后的发展更加迅猛，从研究技术、 方法到研究内容均取得了巨大的进展，衍 生出不同的专业方向，甚至形成了独立的 学科。
药物代谢的研究内容
1. 吸收：药物从给药处进入血液循环的过程，可以从速度 和数量加以定量。通过测定不同时间的血中药物浓度确 定。有关参数：达峰时间（Tmax），峰浓度（Cmax）, 药时曲线下的面积AUC。 2. 分布：药物被血液运送到各组织的过程，也包括速度和 数量上的区别。通过测定不同时间组织中药物含量来确 定。对于动物，可直接取各种组织来测定药物含量。人 则不能直接测定，只能利用数学方法来推算。有关参 数：分布容积（Vα） 3. 代谢（生物转化）：药物在结构上被体内的酶系统改变 的情况。通过鉴定代谢产物的结构来确定。 4. 排泄：药物通过粪便、尿液等从体内排出体外的过程。 通过测定不同时间药物在粪尿中的含量来确定。 3、4合称为药物处置。有关参数：血桨半衰期（T1/2）, 总清除率（CLs）, 肾清除率（CLr）。
2－1 样品的前处理（预处理）
目的： 1.排除内源性杂质的干扰，得到较为“纯净” 的样品； 2.浓集被测组分以满足仪器检测灵敏度的要 求； 3.使呈结合状态的药物水解出来； 4.改变药物的化学性质易适应于分析方法。
2－1－1 去除蛋白
血浆、血清，组织匀浆中含有大量蛋白，一般应先去除，目的是： ①使结合的药物释放出来； ②避免提取时带入杂质和发生乳化； ③避免使色谱测试条件变坏；如柱效下降，柱阻塞； ④使测定灵敏度提高，降低空白值。 去除蛋白的方法： ①蛋白沉淀剂：如三氯醋酸、钨酸盐、高氯酸等。 ②有机溶剂：乙醇、丙酮、乙腈等。 有时去蛋白过程与提取过程可同时完成，如用有机溶剂多次提取时， 蛋白一般均会变性沉淀。因此，可以不必单独进行去蛋白操作。
2-4 化学衍生化
1、样品分子的挥发度和热稳定性，对于GC和GCMS分析特别重要。衍生化可使一些难挥发、热不稳 定的样品利用GC和GC-MS方法测定。 2、生成稳定产物便于提取测定。 3、改善色谱行为：改变保留时间，以便与其它物质 更好地分离，改变极性，减轻拖尾。 4、生成易于检测的产物，以提高灵敏度。
2-2 生物样品的提取方法
考虑提取条件时，可依据药物的特点： ①亲水还是疏水；②解离度； ③酸碱性；④挥发 性；⑤单一组分还是一组组分 ；⑥定性或定量。 衡量提取方法优劣的一个重要指标就是提取回 收率，它是指药物从生物样品中被分离出来用于测 定的比例，一般应高于60%，否则，重现性就很 差。
2－2－1．溶剂提取（液－液提取）
影响提取率和专一性的因素
1.pH值：与药物pka值有关，药物只有以非电离形 式存在时，才能被有机溶剂提取。 因此，对于碱性药物，pH应高于pka值1-2个 pH单位，对于酸性药物，pH应低于pka值1-2个pH 单位，药物可保持在非电离形式。 2.溶剂的极性： 非极性物质易溶于极性小的溶剂中，极性大的 物质则易溶于极性溶剂中，因此，应根据被测组分 的极性选择相似极性的溶剂。 例如，代谢物的极性 通常比母体药物高，因此可利用不同极性的溶剂选 择性地提取母药和代谢物。
溶剂提取的其它问题
1.溶剂的用量：一般与水的比例在1：1或2：1为佳，并非越 大越好。 2.乳化现象：轻微乳化一般离心即可消除。严重乳化（用氯 仿提取时常发生）会导致无法分出有机相，可将其冷冻后再 融化离心，或于提取前加入适量固体NaCl。 3.药物吸附损失：一些药物可被玻璃容器内壁吸附，特别在 药物浓度低时，其对实验结果影响很大。 此时，可对玻璃容 器进行硅烷化处理，或在提取溶剂中加入异戊醇、二乙胺 等。