第二章-细胞的分离与破碎-1

S R R max
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细 胞的破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。 团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般 不宜使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度 上升约2～ 3℃／10MPa，为保护目标产物的 生物活性，需对料液作冷却处理，多级破碎 操作中需在级间设置冷却装置。因为料液通 过匀浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷 却，可有效防止温度上升，保护产物活性。
胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重 组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生， 如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等，基因在宿主细胞内克 隆表达成为基因工程产品，其中许多存在于胞内。
分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得 以释放，才能进一步提取。
细胞的结构
细菌细胞外层结构
微生物 壁厚 /nm 层次
细菌 革兰氏阳性 革兰氏阴性 20～80 单层 肽聚糖 (40%～90%) 多 糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%～4%) 10～13 多层 肽聚糖 (5%～10%) 脂蛋白 脂多糖 (11%～22%) 磷 脂 蛋白质
酵母菌 100～300 多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂 类 (8.5%～13.5%)
梯度 离心
1. 两种区带离心法均事先在离心管中用某种 低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密 度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液 后进行离心操作。 2. 区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。 事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后 在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速 离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 3. 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大 分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限Leabharlann 生产型高压均质细胞破碎机 ：
细胞破碎仪有一个数个往复运动的柱塞，物
料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，
经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失 压的物料以极高的流速（1000-1500米/秒）喷出， 碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，产生三种效 应：空穴效应、撞击效应、剪切效应。经过这三
种效应处理过后，物料粒径可均匀细化到100nm以
形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。
滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和 介质表面不断堆积的滤饼。 2. 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。 由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因
此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或
凝聚等预处理。改变料液的性质，降低滤饼的
阻力。
过滤设备
针式过滤器
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心
力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量
离心程度的参数，用Z表示
Z
4 N r
2 2
g
式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距 离，N为离心机的转数(s-1) 。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因 此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs 为 2 2 2 2 d P ( S L ) N r s 9 L
3、溶液中核酸构象的研究
：单链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA 4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心
超螺旋 DNA
经染料-氯化铯密度梯 度超离心后，质粒DNA 及各种杂质的分布
离心分离设备
1. 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用 的分离设备。实验室用离心机以离心管式 转子离心机为主，离心操作为间歇式。 2. 工业离心分离设备中，较为常用的有管式 和碟片式两大类。
珠磨机的种类很多，处理规模跨度很宽，从实验
规模的组织捣碎机，到工业规模的高速珠磨机。
如WAB公司的Dyno Mill KD45C型最大搅拌速度 为1450rpm(圆周线速度20m/s)，破碎室体积45L。 珠磨机连续操作时，兼具破碎和冷却双重功能，
珠磨法
(Bead mill)
水平搅拌式珠磨机
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃珠、石英砂、氧 化锆等研磨剂(直径＜1mm﹞一起快速搅拌或研磨，研磨剂、 珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞受到研磨剪切和 撞击而破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子 被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产 生的热量采用换热冷却带走。
蛋白质的沉降系数
物质 细胞色素 C 肌红蛋白 胰蛋白酶 尿酶酶 卵白蛋白 α -淀粉酶 血红蛋白 伴刀豆蛋白 A(四聚体) IgG IgM 相对分子质量 12 400 16 900 28 000 32 000 45 000 50 000 64 550 102 300 150 000 900 000～1 000 000 沉降系数 S w0 , 20 / S 1.18 2.04 2.5 2.7 3.7 4.5 4.1～4.5 6.0 6.0～7.8 18～20
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞 大 小 /μ m 2～ 4 2～ 7 2～ 4 6～ 9 7～ 12 20～ 30 离心力 实验室 1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g 工业规模 13 000g 8 000g — — — —
膜分离介质，微滤分离等
过滤操作
对具体过滤处理的不同对象，应根据下列因素，选 取合适的过滤设备：(1)料液的粘度、腐蚀性；(2)固态悬 浮物的粒度、浓度以及变形性等；(3)目的产物是液体部 分还是悬浮固体等。
过滤速度
1. 过滤操作一般以压力差为透过推动力，只靠重 力不能达到足够大的透过速度。过滤操作中固
目的、需低温操作等特点，细胞破碎器采用了
特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有。
高压匀浆
高压匀浆又称高压剪切破碎。高压匀浆器的
破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀
座与阀杆之间的环隙高速(可达到450m/s)喷
出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击 作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器 的操作压力通常为50-70MPa。
出液口
内装微孔滤膜 进液口
微孔滤膜滤器
2.2.2.3 常用过滤设备 生化分离中，工业规模过滤设备主要有加压叶滤机、板框过 滤机、旋转真空过滤机。
过滤板
1钮
滤框
2钮
洗涤板
3钮
板框式压滤机装置及滤板与滤框的构造
板框式过滤机：适用于要求滤饼较干的场合，不适用于含
挥发性有毒物质或有生物危害的场合。
加压叶滤机
2.2 细胞破碎
生物产物可能存在于细胞壁、细胞膜、细胞
质以及线粒体、核糖体、内质网和高尔基体等细
胞器中。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜
受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释
放其中的目标产物。
胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大 多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行 固液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细
或
s
dr dt Sr
2 . N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业
中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。 2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他
g
d p ( S L )g
2
18 L
d 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， p 、 s、 L 和 g 分别表示粒径、固体颗粒密度、液 体密度和重力加速度， g 为重力沉降速度， L 为液体粘度。
菌体和动植物细胞的重力沉降虽 然简便易行，但菌体细胞体积很小， 沉降速度很慢。因此，实用上需使菌 体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行 沉降操作，提高沉降速度。
于实验室水平。
密度梯度离心（density gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
预处理--细胞的分离与破碎
2.1 细胞分离
• 重力沉降 • 离心沉降 • 过滤
重力沉降
重力沉降是化工过程中常用的气固、 液固和液液分离手段，在生化分离过程 中亦有一定程度的应用。
以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的 固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平 衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为
离心沉降
• 离心类别 • 离心沉降速度 • 离心分离法
• 离心分离设备
离心机的种类和适用范 围
低速离心机 转 速 / rpm 离心力 / g 适 用 范 围 细 胞 细胞核 细胞器 蛋白质 2 000～ 6 000 2 000～ 7 000 适用 适用 — — 高速离心机 10 000～ 26 000 8 000～ 80 000 适用 适用 适用 — 超离心机 30000～ 120000 100000～ 600000 适用 适用 适用 适用
区带转子
分析转子
各种转子
管式离心机
碟片式离心机
过滤
• 过滤速度 • 过滤设备
2.2.2 过滤
采用合适的多孔性过滤介质， 可以过滤截留菌体、细胞和碎片等 悬浮液中的固体离子。 织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、
麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等