感染性疾病的分子诊断

• 不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X
S区编码外膜蛋白（HBsAg）
C区编码HBeAg 、HBcAg
p区编码DNA聚合酶
X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表
达有关。
短链S为正链：长短不一精品课件
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pre-s1
pre-s2
HBV基因组结 构
S
HBV DNA 3.2 kb C
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3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相 关信息
临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样 本中仍可以检测出相应的病原体。
有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。
4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不 能说此病原体就是引起疾病的直接原因。
该病原体可能是一种正常菌群
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五、感染性疾病分子诊断 的临床应用及评价
• 完整性策略：
– 检出病原体 – 分型（分类）－亚型－耐药性 – 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
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5
感染性疾病分子诊断标志物
• 病原体核酸分子（DNA/RNA）
• 基因表达产物
• 代谢物
• 免疫应答分子 细
致敏T细胞
胞 免
T
T
疫
淋巴因子
体
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
IgG 临近恢复期出现 IgA
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7
引物A 5’端带 有T7RNA聚
5' 引物A 3'
合酶结合位点， 5'
3’端碱基与靶 3'
RNA 3’端序
5'
列互补;引物B
的碱基序列与
5'
cDNA 3’端序
3'
列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
RNAseH
5' cDNA
3' RNA 5' cDNA
图8-3 NASBA原精理品课示件意图
11
nucleic acid sequence-b精a品se课d件amplification (NASBA)
12
• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
RNAseH
5' cDNA
3' RNA 5' cDNA
图8-3 NASBA原精理品课示件意图
8
nucleic acid sequence-b精a品se课d件amplification (NASBA)
9
Байду номын сангаас
• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
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6
二、感染性疾病分子诊断 的常用方法
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增法。 • 信号放大技术检测方法
靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志 物的浓度使检测信号得到放大。 • 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 • PCR、替代扩增、LCR等
第八、九章 感染性疾病的分子诊断
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1
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
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2
感染性疾病：由某种病原体所致， 通过不同方式引起人体发生感染并 出现临床症状的疾病。
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引物A 5’端带 有T7RNA聚
5' 引物A 3'
合酶结合位点， 5'
3’端碱基与靶 3'
RNA 3’端序
5'
列互补;引物B
的碱基序列与
5'
cDNA 3’端序
3'
列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
核心区：核酸（DNA或RNA）
外周衣壳：蛋白质
包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
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一、 乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人
受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝
炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬
变，HBV又与原发性肝癌密切相关。
外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
pre-c X
P
pre-S1
pre-S2
S
pre-C
C
P
X
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pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
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HBV 基因分型
• HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因 型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基 因型：
病原体：病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、
寄生虫
。
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3
常规检测方法：
•
免疫学方法
•
微生物学方法
受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，
并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信 息。
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4
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体）：
– 判断有无感染 – 是何种病原体感染 – 常用方法：PCR ＋ 杂交
DNA 聚合酶 HBcAg
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Dane颗粒（完整的病毒）形态
HBsAg
（外膜蛋白）
HBcAg
（核衣壳蛋白）
HBV DNA
DNAPol
完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为2精7品纳课米件， 内含DNA双链和DNA多聚酶20
（一）病毒基因组结构
• 3.2kb双链DNA病毒
• 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病 情发展过程的危险性评价及疾病预后等。
• 耐药性的检测 • 细菌的分型 • 流行病调查
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第一节 病毒的基因检测
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝 炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾 病的75%左右。400多种不同病毒。
病毒结构：大 小：20-300nm
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三、感染性疾病分子诊断 的标本处理
• 标本采集处理主要包括选择合适的标本 种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行 合适的传送、保存和预处理。
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四、感染性疾病分子诊断 的结果解释
1. 阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子
2. 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染