感染性疾病的分子诊断
分子诊断的临床应用课件
结 果 95例患者的尿沉渣形态学检查，35例患者的尿沉
尿液中BK病毒核酸定量检测14例尿液中检测到BKV DNA，病毒载量为4×103～2×109/ml，平均为5.6×105/ml。发生病毒尿的中位时间为移植术后14个月。
分子诊断的临床应用
尿液中BK病毒核酸定量检测分子诊断的临床应用42
分子诊断的临床应用
decoy细胞分子诊断的临床应用36
巴氏染色的decoy细胞
未经染色的decoy 细胞
分子诊断的临床应用
巴氏染色的decoy细胞未经染色的decoy 细胞分子诊断的
BK病毒感染的检测
BK病毒的检测血、尿中BK病毒核酸定量检测尿液中decoy细胞检查尿沉渣涂片原位杂交组织病理学检查（判断肾脏间质性肾病）
分子诊断的种高危型HPV。分子诊断的临
细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。
分子诊断的临床应用
细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能
分子诊断的临床应用
DNA重组技术(DNA recombination)
分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊 断，也能确定个体对疾病的易感性，判别 致病基因携带者并对疾病的分期、分型、 疗效监测和预后作出判断。分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组 成部分，成为一门新的学科。Molecular diagnosis Molecular diagnostics
在美国，10岁以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潜伏于肾小管上皮细胞和尿道上皮细胞中。BK病毒重新激活大部分是由于免疫机制缺陷或大量使用免疫抑制剂后。
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿随着科技的不断进步，分子诊断技术在感染性疾病的诊断中扮演着越来越重要的角色。
分子诊断技术通过检测人体内的特定基因、蛋白质以及其他分子标志物，能够准确、快速地诊断出感染性疾病，为临床治疗提供及时有效的指导。
本文将介绍分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿。
一、分子诊断技术简介分子诊断技术是一种利用分子生物学和生物化学的方法进行疾病检测和诊断的新兴技术。
它利用了人体内微量的分子标志物，如DNA、RNA、蛋白质等，通过特定的实验方法进行检测，从而准确地诊断出感染性疾病。
在感染性疾病的诊断中，传统的方法往往需要培养和鉴定病原微生物，操作繁琐、耗时且存在很大误差。
而分子诊断技术则能够通过直接检测病原微生物的核酸或蛋白质等标志物，极大地提高了诊断的准确性和快速性。
二、PCR技术的应用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前应用最广泛的分子诊断技术之一。
PCR技术通过扩增病原微生物的DNA片段，能够在非常短的时间内获得大量特定的基因组DNA。
在感染性疾病的诊断中，PCR技术被广泛应用于包括呼吸道感染、血液感染、泌尿道感染等在内的多个领域。
例如，在呼吸道感染的诊断中，通过采集患者的呼吸道标本，利用PCR技术快速检测出病原微生物的核酸，可以准确地确定感染性病原体，从而指导治疗方案的选择。
PCR技术的快速性和准确性为感染性疾病的早期诊断提供了重要的手段。
然而，PCR技术在一定程度上存在着对特殊设备和操作技术的依赖，同时也容易受到样品质量和操作误差的影响。
三、下一代测序技术的发展随着生物技术的不断发展，下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）逐渐兴起并广泛应用于感染性疾病的诊断中。
NGS 技术能够快速、准确地测序全基因组的DNA或RNA，不受研究对象的限制。
在感染性疾病的诊断中，NGS技术能够对患者样本中的全部基因组进行测序，并通过比对分析找出病原微生物的基因组序列，从而实现全面的病原微生物检测和鉴定。
分子诊断简介介绍
如流式细胞术、免疫细胞化学等，用于检测细胞表型、细胞活性等 。
分子诊断的应用领域
感染性疾病
通过对病原微生物的检测，为 感染性疾病的诊断和治疗提供
依据。
遗传性疾病
通过对基因突变和单基因遗传 病的检测，为遗传性疾病的诊 断、预防和治疗提供指导。
肿瘤
通过对肿瘤相关基因和蛋白质 的检测，为肿瘤的早期发现、 个性化治疗和预后评估提供支 持。
或基因突变。
03
数字PCR
将PCR反应分散到数以万计的微小反应单元中，每个反应单元独立扩增
目标DNA，通过计数反应单元中目标DNA的数量实现高精度定量检测
。
基于分子杂交的技术
基因探针法
利用特异性探针与待测样本DNA 或RNA进行杂交，用于检测特定
基因或病毒。
反向探针法
利用反向探针与待测样本DNA或 RNA进行杂交，用于检测特定基因 或病毒。
实现多组分同时检测和快速分析
多组分同时检测
通过开发多重分析技术，可以在同一反应体 系中同时检测多个目标分子，提高检测效率 ，减少样本消耗量。
快速分析
采用自动化、微流控等技术手段，缩短样本 处理和分析时间，实现快速诊断。这对于紧
急状况下的患者诊断和治疗尤为重要。
推进分子诊断技术的标准化和规范化
标准化的重要性
问题。
重金属检测
利用分子诊断技术可以检测出食 品中的重金属元素，如铅、汞等
，以确保食品的安全性。
转基因食品的检测与标识
转基因成分检测
通过分子诊断技术可以检测出食品中的 转基因成分，帮助消费者了解食品的基 因来源。
VS
标识管理
为确保消费者的知情权，分子诊断技术在 食品标源自上标识转基因成分方面发挥了重 要作用。
感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南
感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南前言感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病，快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。
随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。
为使我国的感染性疾病分子检测临床应用健康有序发展，更好的为医患提供高质量的服务，有必要制订感染性疾病相关的分子检测技术指南，规范临床实验室相关分子检测操作程序，指导从事感染性疾病分子诊断的医务人员正确开展工作。
本指南以大量、丰富的临床实践为基础，同时消化吸取了大量国内外文献的精华，广泛征求相关学科专家的意见，遵循科学性、实用性、可行性的原则，反复修改而成。
我们衷心希望《感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南》能够对广大检验人员起到很好的帮助和指导作用，从而为提高感染性疾病临床诊治水平发挥积极的作用本指南起草单位：中国医科大学附属第一医院、国家卫生计生委临床检验中心本指南起草人：尚红、李金明、郭晓临、代娣、程仕彤目录1. 本指南适用范围 (3)2. 标准术语 (3)3. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测概述 (9)4. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析前质量控制 (12)4.1 标本采集 (13)4.2 标本的转运 (16)4.3 标本的接收 (17)4.4 标本的保存 (18)4.5 检验项目的选择 (19)5. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析中质量控制 (20)5.1 实验室的设计要求 (20)5.2常用的分子检测方法 (21)5.3 试剂和方法的选择 (29)5.4 设备维护和校准 (36)5.5 人员培训 (36)5.6 试剂性能验证 (37)6. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析后质量控制 (40)6.1 结果报告 (40)6.2 结果的解释及医患的沟通 (41)6.3 检测后标本的保存及处理 (42)7. 质量保证 (42)7.1 标准操作程序 (42)7.2 质控品 (42)7.3 室内质量控制 (43)7.4 室间质量评价 (47)8. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测应用 (48)8.1 乙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测 (48)8.2 丙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测 (52)8.3 结核分枝杆菌感染诊疗的个体化分子检测 (56)8.4 人获得性免疫缺陷病毒感染诊疗的个体化分子检测 (57)附录 (65)参考文献 (66)1.本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会编订，是国家卫生计生委个体化医学检测技术系列指南之一，旨为临床实验室进行感染性疾病相关的个体化医学分子检测提供参考和指导。
分子诊断方法检验感染症-检验作业指引
分子診斷方法檢驗感染症 -檢驗作業指引TSLM 分 2-09A-01台灣醫事檢驗學會.twTaiwan Society of Laboratory Medicine1TSLM 分 2-09A-01頁次：第 1 頁共 15 頁分子診斷方法檢驗感染症-檢驗作業指引2008/07/11 一、 引言 臨床醫學實驗室使用分子診斷方法偵測或鑑定微生物已日益普遍。
感染症的分子診斷 技術可提供臨床上快速病原體的診斷、監測及抗藥性偵測。
不管試劑及套組是市售或自行配製，臨床實驗室都有責任瞭解所使用之方法的效 能，合適的運用，並且提供臨床醫師必要的資訊。
然而由於分子診斷方法本身特有的複 雜性及敏感性，因此，在選擇合適的試驗方法及品管方法時須加以規範。
另外，由於方 法種類繁多，無論是臨床診斷用的試劑套組，或是實驗室自行發展的方法，都尚無標準 化的方法以瞭解所使用分子診斷方法的臨床用途及其限制。
因此制訂「分子診斷方法檢 驗感染症之檢驗作業指引」主要的目的就是制訂評估、驗證及確效的準則，使得臨床醫 學實驗室在引進新的分子診斷技術時，有規範可依循。
二、 範圍 A. 提供發展、評估、以及應用分子診斷方法檢驗感染症的一般原則。
B. 適合使用於醫學臨床實驗室。
C. 僅提供定性試驗方法、評估及應用的一般性原則。
三、 應用 由於越來越多的病原體已經被定序出來，因此許多病原體都可以用分子診斷方法 偵測或鑑定，但是仍然應根據臨床需要來決定是否使用分子診斷方法。
最早應用於分 子診斷方法的病原體是不易培養、培養時間長，或是其他技術上的問題（例如檢體運 送不易、發報告時間太長、或是需要特別技術等） 。
發展自動化平台及方法可以縮短 發報告時間，也增加多重反應(multiplexing)的可行性，進而使分子診斷方法可應用的 範圍更廣，也加快病人的治療策略之決定。
臨床使用上仍須考慮許多分子診斷方法的限制：例如因污染或交叉反應引起的偽 陽性結果，或因抑制作用或檢體處理不完全導致的偽陰性結果。
什么是分子诊断
什么是分子诊断分子诊断指的是通过分子生物学检测方法诊断机体中某些遗传物质的方式。
在临床医学领域，分子诊断学的应用非常广泛，其检查结果相对精准且快速。
比如说，分子诊断方式可以应用于产前诊断中，主要检测人体结构中的蛋白、酶、抗原、抗体等基因。
除此之外，分子诊断技术也可以检测出人体的传染性疾病，对影响药物的变异性基因进行鉴别，还可以检测出与癌症有关的基因。
分子诊断必须在符合规定条件的实验室内进行，目的是保证最终的检测结果有效且可靠。
人们可以通过分子诊断发现潜在的基因疾病风险，从而更早的做出风险管理准备，避免疾病发生或加重。
分子诊断也能筛选出更加有效的药物对人体进行治疗，提升医疗质量与效率。
图1即为分子诊断相关内容。
图1一、分子诊断技术分类第一，PCR技术。
PCR技术就是基因扩增技术，其利用了DNA的变性原理与复性原理，通过适温延伸、高温变性和低温复性，使得核酸片段体外扩增，可以将非常少的目标DNA特异的扩增上百万倍，然后分析和检测DNA分子。
整体而言，基因扩增技术灵敏度较高且具有特异性，应用时简便快速，所以已经成为临床基因扩增实验室应用较多且接受程度最高的技术，包含定量PCR和常规PCR。
第二，分子杂交技术。
分子杂交技术的原理是，将两条同源序列核酸单链经过碱基互补配对之后结合形成双链的过程。
该技术可以借助已知序列的基因探针捕获和检测目标序列。
所以杂交双方包含探针与有待探测的核酸，比如基因组DNA或细胞总DNA，可以提纯也可以进行细胞内杂交。
一定要标记探针，然后才可以进行示踪与检测。
分子杂交技术灵敏度高且特异性高，目前多应用于克隆基因的筛选、基因组中特定基因序列的定性、定量检测等。
第三，基因测序技术。
基因测序技术是分子诊断技术的重要分支，能够直接获得核酸序列信息，且是唯一的技术手段。
目前，分子杂交与分子构象变异或定量PCR技术得到了良好发展，但在核酸鉴定方面依然处于间接推断假设阶段，所以特定基因序列检测的分子诊断依然以核酸测序为金标准。
分子诊断技术在感染性疾病中的应用
分子诊断技术在感染性疾病中的应用近年来，随着生物技术的不断发展和进步，分子诊断技术逐渐成为感染性疾病的重要诊断手段。
分子诊断技术凭借其高效、准确的特点，在感染性疾病的早期检测、病原体鉴定以及药物治疗等方面发挥了重要的作用。
本文将对分子诊断技术在感染性疾病中的应用进行探讨。
一、感染性疾病的现状及诊断需求感染性疾病是指由病原体引起的，具有传染性和感染性的疾病，在全球范围内都存在广泛的传播。
传统的疾病诊断方法往往需要较长的时间，且结果可能存在偏差。
因此，为了更好地控制和治疗感染性疾病，寻找一种快速、准确、敏感的诊断方法至关重要。
二、分子诊断技术的原理分子诊断技术主要是通过检测目标病原体的核酸或蛋白质，从而实现对感染性疾病的快速鉴定。
该技术的核心是PCR（聚合酶链式反应）技术，通过扩增病原体的核酸而使其可检测。
此外，还包括核酸杂交技术、电化学检测技术、质谱技术等。
三、1. 早期检测感染性疾病的早期检测对于及时治疗和阻断传播至关重要。
传统的检测方法往往需要培养病原体，耗时且可能错过感染的黄金期。
而分子诊断技术可以通过检测病原体的核酸来进行诊断，大大缩短了检测时间。
例如，在临床应用中，通过PCR技术可以快速检测出致病菌，包括细菌、病毒、真菌等。
2. 病原体鉴定感染性疾病的病原体鉴定是指确定引发感染的具体病原体种类。
传统的方法往往需要进行培养和分离，耗时且可能造成误诊。
而分子诊断技术可以通过比对特定的基因序列，实现快速、准确的病原体鉴定。
例如，在临床中，利用PCR技术可以快速鉴定出引发感染的细菌株，为精确治疗提供了依据。
3. 药物治疗指导感染性疾病的药物治疗往往需要依据病原体的敏感性进行选择。
然而，传统的方法往往依赖于耗时的培养和药敏试验，存在选择压过大和结果不准确的问题。
而分子诊断技术可以通过检测相关基因的表达，预测病原体对药物的敏感性。
例如，在耐药菌的检测中，分子诊断技术可以快速鉴定出耐药基因的存在，从而指导合理的药物治疗。
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用研究方案：分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用一、研究目的与背景感染性疾病是临床上常见的疾病之一，它的早期准确诊断对于治疗和预后至关重要。
目前传统的诊断方法存在时间较长、特异性较差等缺点，无法满足对感染性疾病快速准确诊断的需求。
分子诊断技术应运而生，并被广泛应用于感染性疾病的诊断中，具有高灵敏度和高特异性的优势。
本研究旨在进一步探讨分子诊断技术在感染性疾病中的应用，并提出新的观点和方法，为解决实际问题提供有价值的参考。
二、研究方法1.实验设计本研究采用前瞻性观察设计，共招募X名感染性疾病患者和X名非感染性疾病患者作为对照组。
在患者入组后，采集其血液和其他相关样本，进行分子诊断技术的检测，并与传统的诊断方法进行对比。
2.采集样本2.1 血液样本：每例患者采集X ml抗凝血液样本，其中X ml用于传统的检测方法，X ml用于分子诊断技术的检测。
2.2 其他相关样本：根据疾病特点，采集适当的其他相关样本，如尿液、唾液或者呼吸道分泌物等，用于分子诊断技术的检测。
3.分子诊断技术检测3.1 核酸提取：将采集到的样本进行离心分离，分离出核酸。
3.2 PCR扩增：采用特异性引物和逆向转录酶，对核酸进行PCR扩增。
3.3 实时荧光定量PCR：将扩增产物与特异性探针结合，进行实时荧光定量PCR检测。
3.4 基因芯片：将样本中的核酸转录为亮点，通过基因芯片检测亮点的信号强度和分布来进行分子诊断。
4.数据采集与分析4.1 观察指标：观察指标主要包括分子诊断技术的准确性、灵敏度、特异度和重复性等。
4.2 数据采集：根据实验设计采集患者的临床信息、实验结果等数据，并将其录入电子表格。
4.3 数据分析：采用统计学方法对数据进行描述性统计和比较分析，如计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等。
三、数据整理与分析1.整理数据1.1 检查测定数据：将分子诊断技术的检测结果根据不同疾病分类整理，并计算其准确性、灵敏度和特异度。
分子生物学技术在感染性疾病诊断中的应用进展
ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２１．０２．０１·专家论坛·分子生物学技术在感染性疾病诊断中的应用进展 作者简介：吕晶南，１９８９年生，女，技师，硕士，从事临床微生物检验工作。
通信作者：余方友，主任技师，博士研究生导师，博士，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｚｊｘｙｆｙ＠１６３．ｃｏｍ。
吕晶南１，余方友２（１．苏州大学第二附属医院检验科，江苏苏州２１５００４；２．同济大学附属上海市肺科医院检验科，上海２０００８２）摘要：临床常见病原菌的检测方法中，传统的病原菌分离培养及表型鉴定方法检测周期耗时长，且操作繁琐、敏感性低、特异性差。
相比这下，分子诊断技术可有效弥补传统方法的不足，尤其是２０１９新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ）的暴发，使分子生物学理论和技术飞速发展并得到广泛应用，对指导临床预防、诊断、治疗及疗效评价起到重要的作用。
该文从呼吸道感染、中枢神经系统感染、血流感染及胃肠道感染４个方面系统化介绍核酸检测技术在病原体鉴定中的应用，同时阐述这些方法在临床实验室应用时可能遇到的挑战和机遇。
关键词：分子生物学技术；分子诊断技术；感染性疾病；病毒中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：Ａ ２０１９新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ）的暴发，使分子生物学技术在临床感染性疾病诊断、治疗、疗效评价及预防等方面得到前所未有的重视和飞速发展。
本文就近年来基于核酸检测技术鉴定病原体进行系统化讨论，同时也对这些方法在临床实验室应用时可能遇到的挑战和机遇进行阐述。
１ 呼吸道感染１．１ 病毒 呼吸道病毒的感染对全球流行病公共卫生可引起严重的威胁，如１９１８年甲型流感大流行，２００３年严重急性呼吸系统综合征（ＳＡＲＳ）冠状病毒暴发，２００９年甲型Ｈ１Ｎ１流感引起的大流行，２０１２年阿拉伯半岛出现由冠状病毒引起的中东呼吸综合征（ＭＥＲＳ），２０１９年２０１９ ｎＣｏＶ的暴发。
值得注意的是，仅基于体征和症状区分病毒来源较困难，同时不同病毒感染采取的治疗方案不同，因此，呼吸道病毒对人类健康构成严重威胁［１］。
利用宏基因二代测序技术进行感染性疾病患者的分子诊断
利用宏基因二代测序技术进行感染性疾病患者的分子诊断近年来，感染性疾病一直是全球关注的热点问题。
为了更好地了解感染性疾病的病原体和其发展机制，很多研究者开始采用宏基因二代测序技术进行分子诊断。
宏基因测序技术在病原体研究方面具有许多优势，比如高通量、高准确率和覆盖范围广等。
本文将详细介绍利用宏基因二代测序技术进行感染性疾病患者的分子诊断的方法以及该技术的应用前景。
首先，我们需要大体了解宏基因二代测序技术的原理和流程。
宏基因测序是指通过将DNA进行扩增，将其分离并进行高通量测序，然后通过生物信息学方法分析获得的数据，从而得到生物体内所有的基因信息。
这种技术的主要特点是可以同时对多个样本进行测序，并高效地得到大规模的基因数据。
在感染性疾病患者的分子诊断中，宏基因测序技术可以用于确定病原体的种类、数量和变异情况。
首先，需要收集感染性疾病患者的病原体样本，如血液、呼吸道分泌物等。
然后，通过提取样本中的DNA或RNA，建立合适的文库。
接下来，使用特定引物和PCR技术扩增目标序列。
然后，将扩增得到的文库进行高通量测序。
最后，使用生物信息学方法对测序结果进行筛选、比对和分析，以确定感染性疾病患者体内存在的病原体、药物抗性基因等信息。
宏基因测序技术可以提供大量的分子信息，从而更全面地了解感染性疾病患者体内的病原体群落。
通过对不同感染性疾病患者的样本进行宏基因测序，可以发现病原体的种类和变异情况，为感染性疾病的诊断和治疗提供更准确的依据。
同时，宏基因测序可以分析感染性疾病患者体内的潜在耐药基因，帮助医生选择合适的抗生素进行治疗，减少药物的滥用和耐药性的发展。
此外，宏基因测序技术还可以应用于研究感染性疾病的发展机制和传播途径。
通过对不同时间点、不同地理位置或不同人群感染性疾病样本的宏基因测序，可以揭示感染源和传播路径，为预防和控制感染性疾病提供科学依据。
相比传统方法，宏基因测序技术具有较高的灵敏度和覆盖范围，极大地增加了我们对感染性疾病的理解。
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精品课件
1
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人件
2
感染性疾病：由某种病原体所致， 通过不同方式引起人体发生感染并 出现临床症状的疾病。
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
RNAseH
5' cDNA
3' RNA 5' cDNA
图8-3 NASBA原精理品课示件意图
8
nucleic acid sequence-b精a品se课d件amplification (NASBA)
9
• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
精品课件
15
3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相 关信息
临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样 本中仍可以检测出相应的病原体。
有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。
4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不 能说此病原体就是引起疾病的直接原因。
该病原体可能是一种正常菌群
精品课件
16
五、感染性疾病分子诊断 的临床应用及评价
DNA 聚合酶 HBcAg
精品课件
19
Dane颗粒（完整的病毒）形态
HBsAg
（外膜蛋白）
HBcAg
（核衣壳蛋白）
HBV DNA
DNAPol
完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为2精7品纳课米件， 内含DNA双链和DNA多聚酶20
（一）病毒基因组结构
• 3.2kb双链DNA病毒
• 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病 情发展过程的危险性评价及疾病预后等。
• 耐药性的检测 • 细菌的分型 • 流行病调查
精品课件
17
第一节 病毒的基因检测
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝 炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾 病的75%左右。400多种不同病毒。
病毒结构：大 小：20-300nm
• 完整性策略：
– 检出病原体 – 分型（分类）－亚型－耐药性 – 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
精品课件
5
感染性疾病分子诊断标志物
• 病原体核酸分子（DNA/RNA）
• 基因表达产物
• 代谢物
• 免疫应答分子 细
致敏T细胞
胞 免
T
T
疫
淋巴因子
体
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
IgG 临近恢复期出现 IgA
精品课件
10
引物A 5’端带 有T7RNA聚
5' 引物A 3'
合酶结合位点， 5'
3’端碱基与靶 3'
RNA 3’端序
5'
列互补;引物B
的碱基序列与
5'
cDNA 3’端序
3'
列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
• 不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X
S区编码外膜蛋白（HBsAg）
C区编码HBeAg 、HBcAg
p区编码DNA聚合酶
X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表
达有关。
短链S为正链：长短不一精品课件
21
pre-s1
pre-s2
HBV基因组结 构
S
HBV DNA 3.2 kb C
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
精品课件
6
二、感染性疾病分子诊断 的常用方法
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增法。 • 信号放大技术检测方法
靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志 物的浓度使检测信号得到放大。 • 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 • PCR、替代扩增、LCR等
pre-c X
P
pre-S1
pre-S2
S
pre-C
C
P
X
精品课件
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
22
HBV 基因分型
• HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因 型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基 因型：
精品课件
7
引物A 5’端带 有T7RNA聚
5' 引物A 3'
合酶结合位点， 5'
3’端碱基与靶 3'
RNA 3’端序
5'
列互补;引物B
的碱基序列与
5'
cDNA 3’端序
3'
列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
核心区：核酸（DNA或RNA）
外周衣壳：蛋白质
包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
精品课件
18
一、 乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人
受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝
炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬
变，HBV又与原发性肝癌密切相关。
外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
病原体：病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、
寄生虫
。
精品课件
3
常规检测方法：
•
免疫学方法
•
微生物学方法
受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，
并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信 息。
精品课件
4
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体）：
– 判断有无感染 – 是何种病原体感染 – 常用方法：PCR ＋ 杂交
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
RNAseH
5' cDNA
3' RNA 5' cDNA
图8-3 NASBA原精理品课示件意图
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nucleic acid sequence-b精a品se课d件amplification (NASBA)
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• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
精品课件
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三、感染性疾病分子诊断 的标本处理
• 标本采集处理主要包括选择合适的标本 种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行 合适的传送、保存和预处理。
精品课件
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四、感染性疾病分子诊断 的结果解释
1. 阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子
2. 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染