第八章 植物基因的克隆原理与技术
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类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精 确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300种 微生物中分离出了2300种，其中商品化的限制性核酸内切酶 500余种。
.
限制性核酸内切酶的命名
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜 体字母的略语表示酶来源的菌种名称。
4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如Eco R I、 Hin d III
.
限制性核酸内切酶的分类
限制性内切核酸酶类型： 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
.
不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析
I型
II 型
III 型
限制-修饰活性
单一多功能的 酶
限制酶和修饰酶 分开
内切酶的蛋 白质结构 3种不同亚基
单一成分
活性辅助因子
甲基化位点 特异性切割 基因克隆中的
用途
ATP、Mg2+、 SAM
Mg2+
寄主特异性的位点
否
是
用途有限
十分广泛
.
双功能酶
2种不同亚基 ATP、Mg2+、
SAM
否 用途有限
II型限制性核酸内切酶的3大特点
识别位点的特异性 识别序列的对称性 切割位点的规范性
.
1– 工具酶的发现和应用
Werner Arber 1968年发现限制酶
Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，
1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内
切酶。 .
1– 工具酶的发现和应用
1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，
特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连
1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的命名和分类 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应
.
限制性内切核酸酶的发现 50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制 系统； 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统； 1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制 性核酸内切酶； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一 个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确 切割成为可能。
如：大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco ；
属名
种名
流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；
.
2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco
3、用一个正体字母表示菌株的类型 如Escherichia coli RY13 Eco R
.
Xma I Sma I
5’-C CCGGG -3’ 3’-GGGCC C-5’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同 粘性末端的一类限制性核酸内切酶。
注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接， 但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段 将不能被该两种酶的任一种所识别。
第八章 植物基因的克隆原理与技术
.
• 内容 • 一．基因克隆所需要的酶和载体 • 二．植物转化载体的构建 • 三．基因克隆的方法
.
基因克隆所需要的酶和载体
.
一般认为 基因工程诞生于1973年 上世纪40年代——70年代初
分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
这一年被定为基因工程诞生的元年。
.
植物基因工程的基本流程
提取 目的DNA 酶切 DNA片段 载体
导入到细菌中
重组菌的筛选
序列分析和基因表达等研究
.
基因克隆所需要的酶类
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶 • DNA修饰酶 • 核酸外切酶 • 单链DNA内切酶
“
”
.
限制性核酸内切酶
接活性。
.
2– 反转录酶的发现和应用
1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善 了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。
.
3– 载体的发现和应用
1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实 现了DNA的体外重组。
.
3– 载体的发现和应用
197Biblioteka Baidu年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实 现了细菌间性状的转移。
.
1-- DNA是遗传物质被证实
1944年，Avery O.T.肺炎双球菌转化实验
.
2-- DNA双螺旋模型的提出
Watson 和Crick
1953年，James Watson 和Francis Crick提出 了DNA的双螺旋模型。 .
3– “中心法则”的提出
以Nireberg等为代表的一批科学家 确定了遗传信息以密码方式传递， 每三个核苷酸组成一个密码子，代 表一个氨基酸，到1966年，全部破 译了64个密码子，并提出了遗传信 息传递的“中心法则”。
.
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端 ( cohesive ends )：因酶切位点在两条DNA单链上不同 （对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产 生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
5’端凸出（如EcoR I）
3’端凸出（如Pst I）
.
平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同， 酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起 来。
.
限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内 的外源DNA切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化 酶甲基化修饰所保护，不能被 自身的限制性内切酶识别切割。
.
限制性核酸限内制切性酶（核R酸es内tric切tio酶n e的ndo概nu念cleases）：是一
.
同裂酶 (isoschizomers )：能识别和切割同样的核苷酸靶序 列的不同内切酶。
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同
如Hind Ⅲ和Hsu I
不完全同裂酶 识别位点相同但切点不同
如Xma I 和 Sma I
Hind Ⅲ 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’
Hsu I 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’
.
限制性核酸内切酶的命名
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜 体字母的略语表示酶来源的菌种名称。
4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如Eco R I、 Hin d III
.
限制性核酸内切酶的分类
限制性内切核酸酶类型： 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
.
不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析
I型
II 型
III 型
限制-修饰活性
单一多功能的 酶
限制酶和修饰酶 分开
内切酶的蛋 白质结构 3种不同亚基
单一成分
活性辅助因子
甲基化位点 特异性切割 基因克隆中的
用途
ATP、Mg2+、 SAM
Mg2+
寄主特异性的位点
否
是
用途有限
十分广泛
.
双功能酶
2种不同亚基 ATP、Mg2+、
SAM
否 用途有限
II型限制性核酸内切酶的3大特点
识别位点的特异性 识别序列的对称性 切割位点的规范性
.
1– 工具酶的发现和应用
Werner Arber 1968年发现限制酶
Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，
1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内
切酶。 .
1– 工具酶的发现和应用
1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，
特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连
1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的命名和分类 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应
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限制性内切核酸酶的发现 50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制 系统； 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统； 1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制 性核酸内切酶； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一 个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确 切割成为可能。
如：大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco ；
属名
种名
流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；
.
2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco
3、用一个正体字母表示菌株的类型 如Escherichia coli RY13 Eco R
.
Xma I Sma I
5’-C CCGGG -3’ 3’-GGGCC C-5’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同 粘性末端的一类限制性核酸内切酶。
注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接， 但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段 将不能被该两种酶的任一种所识别。
第八章 植物基因的克隆原理与技术
.
• 内容 • 一．基因克隆所需要的酶和载体 • 二．植物转化载体的构建 • 三．基因克隆的方法
.
基因克隆所需要的酶和载体
.
一般认为 基因工程诞生于1973年 上世纪40年代——70年代初
分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
这一年被定为基因工程诞生的元年。
.
植物基因工程的基本流程
提取 目的DNA 酶切 DNA片段 载体
导入到细菌中
重组菌的筛选
序列分析和基因表达等研究
.
基因克隆所需要的酶类
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶 • DNA修饰酶 • 核酸外切酶 • 单链DNA内切酶
“
”
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限制性核酸内切酶
接活性。
.
2– 反转录酶的发现和应用
1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善 了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。
.
3– 载体的发现和应用
1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实 现了DNA的体外重组。
.
3– 载体的发现和应用
197Biblioteka Baidu年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实 现了细菌间性状的转移。
.
1-- DNA是遗传物质被证实
1944年，Avery O.T.肺炎双球菌转化实验
.
2-- DNA双螺旋模型的提出
Watson 和Crick
1953年，James Watson 和Francis Crick提出 了DNA的双螺旋模型。 .
3– “中心法则”的提出
以Nireberg等为代表的一批科学家 确定了遗传信息以密码方式传递， 每三个核苷酸组成一个密码子，代 表一个氨基酸，到1966年，全部破 译了64个密码子，并提出了遗传信 息传递的“中心法则”。
.
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端 ( cohesive ends )：因酶切位点在两条DNA单链上不同 （对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产 生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
5’端凸出（如EcoR I）
3’端凸出（如Pst I）
.
平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同， 酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起 来。
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限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内 的外源DNA切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化 酶甲基化修饰所保护，不能被 自身的限制性内切酶识别切割。
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限制性核酸限内制切性酶（核R酸es内tric切tio酶n e的ndo概nu念cleases）：是一
.
同裂酶 (isoschizomers )：能识别和切割同样的核苷酸靶序 列的不同内切酶。
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同
如Hind Ⅲ和Hsu I
不完全同裂酶 识别位点相同但切点不同
如Xma I 和 Sma I
Hind Ⅲ 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’
Hsu I 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’