TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA 的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

一、过氧化物酶标记测定法

原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

检测晚期凋亡。

基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

罗氏试剂盒

一、试剂1、酶浓缩溶液5×50μl——末端脱氧核糖核酸转移酶（10×）试剂

2、标记溶液5×550μl——含有核苷酸混合液的反应液（1×）试剂

3、转化剂-POD 3.5ml——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后4℃保存）

二、所需的溶液和仪器

10mM Tris/HCl（pH7.4~7.8）、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）

1,充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min×5；

②3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min，抑制内源性过氧化氢酶。

③用蛋白酶K（20μg/ml溶于Tris/HCl中，pH7.4~8.0）室温孵育15~30分钟。

④PBS洗约5min*2次，擦干样品周围的水。此阶段配制TUNEL反应混合物——从试剂2中取出100μl标记溶液作为两个阴性对照；将试剂1中取5μl+试剂2中45μl标记液中，配成50μl TUNEL反应混合物混匀（即配即用，4℃避光！）

⑤标记反应：滴加50μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60分钟（为防蒸发和保证TUNEL反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*3次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。

⑥信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul转化剂-POD，湿盒中37℃孵育20~30分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*3~5次

⑦加入50~100μl DAB底物溶液，室温（10~25℃）孵育5~10min，PBS洗5min*3次。（苏木素染1-3秒，以免视野全染，需要摸索条件）

⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果。•稳定性：TUNEL反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好的此液体必须将放入冰浴中。

2、转化剂-POD（即用型）：一旦融化此液体，需在4℃保存（最多保存6个月），并且不能反复冻存。

蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA）；

注意：

1)蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（come off the slide）,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30min，4um左右的片子可以用10min，但30um左右的可用30min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

2)对于比较困难的组织，可以选用0.1M pH6.0的枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），200ml需350W 修复5min

3)对照：阴性对照：经过固定和通透的细胞样品加入50μl试剂2以代替TUNEL反应混合物，从标记步骤以下同上。阳性对照：经过固定和通透的细胞样品用细球菌的核酸酶或DNase I使之产生DNA链缺口，从标记步骤以下同上。

4)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加TUNEL反应混合物，37℃孵育60分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂-POD，37℃孵育30分钟——洗样品——滴加DAB底物溶液，室温孵育5-20分钟——光镜下分析结果

5)假阳性多的原因有很多：POD封闭不全、DAB显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是DAB孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强PBS浸洗

6)DAB显色时间:

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

7)脱片产生的原因和如何防止脱片:

（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。

（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

（3）组织的问题，越是有坏死之类越容易脱。

（4）没烤好，时间短温度不够之类。

（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

（6）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。