SNP开发验证的研究方法和技术路线

SNP开发/验证的研究方法和技术路线

1分子标记：

分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间的分子标记，尤其是SNP标记。

1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：

一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。

目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。

番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。

1.2全基因组SNP—Douglas：

当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也

可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。3）对于一些高信息量，均匀分布在全基因的SNP分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，一套完整能够与Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。

图1.1 QTL区间上的SNP标记分布图

注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。

1.3 Douglas系统下SNP标记的开发

通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反应体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。

1.3.1 供试材料：

22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。

对于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。

1.3.2 DNA提取：

1. 取~10mg 植物组织，加入研磨介质和400μl 裂解液，研磨5min，3000g 离心5min。

2. 加入裂解液1/3 体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g 离心10min，吸取上清300~400μl 加入到样品板中。

3. 按照下表在各96 孔板中加入试剂：

板号板型板名成分样品及试剂体积

1 Microtiter deep well

96plate 样品板（Lysis）样品反应液

无水乙醇

300~400μl

400μl

2 Microtiter deep well

96plate 洗涤板I（W1）PW

磁珠

800μl

30μl

3 Microtiter deep well

96plate 洗涤板II（W2）80%乙醇

磁套

800μl

4 KingFisher 96 KF plate 洗脱板（Elution）TE1.0 50~100μl

4. 将各96 孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。

5. 程序运行结束后，将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度（>100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。

1.3.3 分子标记命名：

分子标记全部采用统一的命名规则，这样有利于结果的修改与维护。例如：

引物合成：由生工公司负责引物合成。

1.3.4 SNP分子标记的开发：

最近，Sim等人利用番茄的Illumina芯片检测410份自交系与16份番茄品种的基因型。本研究在此基础上，利用Illumina开发的7,720条探针序列，选择其中丢失频率小于10%，等位基因频率大于10%的探针序列，获得~3,500条探针序列，作为SNP引物开发的模板序列（），每条序列的长度为~100bp，SNP 上下游各50bp。

初期，我们可以从~3500条探针中，选取~120探针序列作为模板发展引物，这120条序列要求分布在12条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。如果实验成功，我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为SNP引物。

1.3.5正向引物设计：

由于我们需要使用KASP基因分型检测试剂盒，本试剂盒对正向引物已经确

定为SNP位点上游~20bp（包括SNP位点），同时需要人工加上FAM或是HEX序列（图1.2）。因此，我们需要单独设计反向引物。

图1.2 正向引物设计

1.3.6反向引物设计：

利用Primer3.0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：

1 引物长度为18~25bp；

2 GC含量为40~60%；

3 TM值58~62°C。

如果其上述模板序列不足以满足引物开发的需要：我们可以利用剩余~4,200条探针，继续开发新的引物。另外，我们还可以利用PCR产物测序的方式获得gap中序列，寻找新的SNP位点。

1.3.6 PCR反应：

PCR反应体系：PCR反应体系需要保证均一化，这样可以满足将来在Douglas 系统下进行SNP检测。初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。

Primer Mix反应体系：

名称体积（μl）

FAM-Primer 12

HEX-Primer 12

Reverse-Primer 30

ddH2O 46

Total 100