秀丽线虫基因敲除突变库中sec-10突变种系的筛选
秀丽线虫综述 (1)
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喂养方法
➢ 用冰M9缓冲液清洗虫体 ➢ 置4℃环境20min ➢ 1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬 ➢ 置4℃环境20min 弃上清 ➢ 取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的 NGM培养基上 ➢将培养基放置到16℃生化培养箱中，72h后可繁育至第二 代
精选课件
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• 冻存 准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲
秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途
精选课件
By 王传杰
1
介绍
• 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）,属于线形动物 门、线虫纲。体形非常小,成虫只有1mm左右。 线 虫 是 细 胞 定 数 动 物 ， 两性 成虫 只有 9 5 9 个 体 细 胞 ， 雄 性 成 虫 只 有 1 0 3 1 个 体细 胞 ， 其 中 1 3 1个 细 胞 注 定 要 接 一 定 的发 育 程 序 陆续 死 亡 。 神 经 系 统解 剖结 构 十 分 简 单 ， 仅有 3 0 2个细 胞 ， 约 占整 个 动 物 体 细 胞 总 数 的 三 分 之 一 。它身体透明,能感 知气味和味道,对光线、温度有反应。研究者很容易在显 微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察
显微注射后的整合
•目前常用的整合方法有：用 y射线和 X射线照射，或用光敏剂补骨脂素 加长波紫外线照射整合(TMP/UV integration)． 基本策略是大量筛选经 •射线照射过的转基因线虫，一般挑取数百只 F1 代繁殖，筛选 F4 代， 检测是否有 100%的转基因表达，若是则说明整合成功． 一般一次整合 能得到若干个独立种系，可选择最好的一个进行实验．
出
容易脱水 而死
后的性腺被液体充 满．
精选课件
秀丽线虫
性别不同具有不同的细胞数。雌雄同体成虫含有959个体细 胞，约2000个生殖细胞，而雄性成虫则具有1031个体细胞 和1000个生殖细胞。
5.秀丽线虫有两种性别：雌雄同体和雄性。 雌雄同体可进行自我繁殖，也可与雄性交配繁殖；与雄
性交配的后代，50%是雌雄同体，50%为雄性。自我繁殖的 大多是雌雄同体，雄性个体以很低的频率自发产生。一条未 经交配的雌雄同体在生殖期可产生约300个后代。若与雄性 个体交配则产生多达1000个。
John E. Sulston
H. Robert Horvitz
2002年，Brenner和Horvitz、Sulston对器官 发育的遗传基础及程序性细胞死亡基因调控机 制的揭示，荣获了诺贝尔生理医学奖
Sydney Brenner
Andrew Z. Fire
Craigc. Mell
2006年，安德鲁· 法尔和克雷格· 梅洛获得诺贝尔生理医学奖， 以表彰他们发现了RNA干扰现象。
参考文献：
[1] Breener.S, The genetics of Caenorhabditis elegans [J].Genetics ,1974,77(1):7194 [2] /view/705699.htm [3] Stephen.J, Kenney.A, Garyl, et al. Persistence of EscherichiacoliO157: H7, Salmonella Newport and Salmonella Poona in thegut of a free-living nematode, Caenorhabditis elegans, and trans-mission to progeny and uninfected nematodes [ J]. International Journal of Food Microbiology,2005, 101: 227-236. [4] 庞林海，杜爱芳，李孝军等.秀丽隐杆线虫培养特性与保存方法研究[J].浙江农业学 报，2007,19（1）：34-36 [5] Sulston JE. Neuronal cell lineages in the nematode, Caenorhabditis elegans [J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1983,48(2):443-452 [6] Simonetta SH, Golombek DA. An automated tracking system for Caenorhabditis elegans locomotor behavior and circadian studies application[J]. J Neurosci Methods, 2007, 161:273— 280． [7] Benedetti MG Foster AL，Vantipalli MC，et a1．Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan[J]. Exp Gerontol, 2008, 43:882—89 1． [8] Verwaerde P'Cuvillier G Improved assay techniques using nematode worms： USA，US7083947[PI．2006-08—01．
秀丽隐杆线虫
分类号编号烟台大学毕业论文利用秀丽隐杆线虫筛选抗白色念珠菌活性物质Screening anti-Candida albicans substances using Caenorhabditis elegans利用秀丽隐杆线虫筛选抗白色念珠菌活性物质摘要：以秀丽隐杆线虫作为模型生物进展抗菌物质筛选。
用白色念珠菌感染线虫后，采用不同浓度的抗菌药物治疗，观察线虫存活情况，确定适宜用药浓度；采用微拟球藻提取物对白色念珠菌感染线虫治疗，观察线虫存活情况，与抗菌药物作用效果比照，从而筛选出可用于治疗白色念珠菌活性物质。
实验发现，添加10~20mg/L的氟康唑对感染白色念珠菌的秀丽隐杆线虫治疗效果较好，在一定剂量范围内，治疗效果和剂量成线性关联；微拟球藻提取物不具备抗菌活性。
关键词：秀丽隐杆线虫；白色念珠菌；抗菌物质Abstract: In the study, Caenorhabditis elegans were used as model organism to screen antibacterial agents. C.elegans were infected by Candida albicans and treated by different concentrations of antibacterial agents which had been known and extracts from Nannochloropsis OZ-1, observating the survival situation and comparing the effects of the two antibacterial agents, thus, the bioactive substance could be screened which cured the Candida albicans. The result showed that Candida albicans could be treated by 10~20 mg/L Fluconazole, moreover within the scope of the dose, treatment effect and the dose of a linear correlation. And the results showed that extracts from Nannochloropsis OZ-1 did not have antibacterial activity.Key words:C.elegans；Candida albicans；Antibacterial substances目录1 文献综述 (5)1.1 秀丽隐杆线虫 (5)1.2 秀丽隐杆线虫研究进展 (5)1.2.1 环境毒理学的研究 (6)1.2.2 程序性细胞死亡的研究 (6)1.2.3 秀丽隐杆线虫感染模型的建立 (6)1.2.4 抗菌物质作用机制的研究 (6)1.2.5 病菌致病机制和线虫免疫机制的研究 (7)1.3 白色念珠菌 (7)1.4 抗菌物质的筛选 (8)1.5 实验研究意义 (9)2 材料和方法 (10)2.1 材料 (10)2.1.1 实验药品 (10)2.1.2 实验仪器 (10)2.1.3 线虫和菌株 (11)2.1.4 培养基 (11)2.1.5 试剂 (11)2.2 方法 (11)2.2.1 线虫培养和保存 (11)2.2.2 线虫同步化 (11)2.2.3 线虫真菌感染 (12)2.2.4 线虫抗感染治疗 (12)2.2.5 观察 (12)3 实验结果分析 (9)3.1 氟康唑用药浓度的选择 (9)3.2 筛选可用于治疗白色念珠菌的微拟球藻提取物 (9)4 结论 (12)致谢 (13)参考文献 (14)1 文献综述1.1 秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫[1]〔Caenorhabditis elegans〕〔图1〕是一种多细胞真核生物，个体很小，以细菌为食，可独立生存在温度恒定环境中，对人、动植物没有危害。
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用秀丽隐杆线虫是一种常见的实验室模式生物，通常被用于生理学、神经学和药理学等研究领域。
随着科技的不断发展，人们越来越发现秀丽隐杆线虫的潜力以及应用价值，尤其是在药物筛选过程中。
下面，本文将为大家介绍秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用。
秀丽隐杆线虫的基本特点秀丽隐杆线虫的一个重要特点是其生命周期短。
它的寿命大约为2-3周，从卵发育到成虫只需要3到4天，这使得生物实验更方便、快捷。
此外，秀丽隐杆线虫的身体结构简单，易于观察、操作和控制。
药物筛选药物筛选（Drug screening）是将可能具有治疗作用的化学物质进行筛选，以发现新的药物或治疗手段的过程。
经过多年的探索和发展，人们已经发现了一些能够抑制乃至治愈某些疾病的药物。
但是，受到次级反应、耐药性以及毒副作用的限制，现行的药物仍然存在局限性。
因此，对药物的筛选和研发仍然是重要的科学问题。
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用秀丽隐杆线虫作为一种便于操作的模式生物，可应用于各种药物筛选实验。
其基本筛选过程通常分为以下几个步骤：1.选择适当的突变体作为实验对象线虫有数千种基因变异体可用于研究。
因此，选择适当的突变体可大大提高实验的成功率。
例如，翻译抑制线虫能够胜任神经学实验，易造成神经元死亡的突变体便于设计细胞毒性实验。
2.将样本与药物混合在进行实验之前，需要将样本与待测药物混合。
线虫通常生活在标准培养液中，药物可通过不同的给药方式添加入培养液。
比如，可直接加入到培养液或用食物富含药物等等。
3.检测线虫反应添加药物后，需要观察并记录线虫的反应。
由于线虫身体简单，因此人们可以便捷地观察突变体或线虫的行为、发育和生存等指标，如运动速度、排便频率、生育率以及寿命等。
4.分析数据采集反应记录数据后，通常需要进行统计学分析处理，来证明线虫是否与药物有明显的互动影响。
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的亮点基于其适用范围广泛、反应速度快等特点，秀丽隐杆线虫已经逐渐成为药物筛选中不可或缺的一种重要类别。
浅谈秀丽隐杆线虫的模型建立与研究进程
浅谈秀丽隐杆线虫的模型建立与研究进程作者：邓阳来源：《大东方》2017年第04期摘要：秀丽隐杆线虫作为一种简单的多细胞真核生物由于具有较多优点成为科研者建立模型与药物靶点研究与新药研制的重点研究生物。
本文仅将近年来秀丽隐杆线虫的特点、模型建立及研究进展作简要整理与分析。
关键词：秀丽隐杆线虫；模型筛选建立一个较为优良的筛选模型，至少应具备良好的稳定性、重复性和可操作性这些特征。
在传统的药物研究中，实验者往往使用小鼠、兔子作为模型研究药物靶点和进行药物研发，但这些动物模型具有传代时间长、受环境因素影响较强、实验结果准确性低等缺点，而秀丽隐杆线虫作为一种操作较为简便的生物逐渐被尝试，优点也不断显现。
一、秀丽隐杆线虫（以下简称线虫）的“秀丽”之处1.易于培养。
实验过程中线虫一般在琼脂平板上或液体培养基中培养，温度在20℃左右，以E.coli OP50为食。
能在-80℃冰箱长期保存[1]，因其稳定性较强而便于保存与使用。
2.繁殖快，且产后代数量多，成本较低。
其绝大多数个体为雌雄同体，雄虫仅占0.05%。
一只雌雄同体野生型线虫可以产出 300个左右的后代，其在产卵期产卵，优先选择雄性的精子。
若与雄虫交配，后代数则可多达1000个。
20℃时，野生型线虫发育一个世代仅需要3d左右，平均寿命为2-3 周。
3.线虫以动物整体作为实验对象，同时规模容易进行扩大研究。
线虫成虫体长仅1mm，体径30μm，结构相对简单。
从最初的培养板准备，到最终目的线虫筛选或特定量化性质的测定均可以实现全/半自动化，因此具有较高的操作性，准确率高。
目前研究者已完成线虫全基因组测序，并且这些基因中高达42%的基因与人类基因同源[1，2]，其遗传背景相对清晰。
因此作为整体动物实验，当药物在体内的作用靶点不止一个时，往往能提供更准确的评估。
4.线虫身体透明，便于染色、观察与荧光标记。
这一特点已被用于基于线虫的高通量筛选并获得了成功[3]。
二、药物模型的建立1.抗衰老药物模型的建立自20世纪70年代开始，研究者便开始逐步将秀丽隐杆线虫模型用于人体衰老、神经生理学等领域的研究。
秀丽隐杆线虫作为抗感染药物筛选模型的研究进展
近年来 ， 线 虫 模 型 的发 展 推 进 了我 们 对 于 一些 感 染 类 疾
病 发病 机制的理解 ， 而对疾病本质 的深刻认识 自然会 为感染 类 疾病的治疗提供启示 ， 同时也 大大加速 了新 型抗 生素 的发
现。Ｅ ｗ ｂ ａ ｎ ｋ等 综述 了一些种族 抗菌 肽和蛋 白质 ， 可作 为 候选新型抗生素 。并且 阐述 了线 虫感染 系统提供 新 型抗 生 素大规模体 内筛选 的可能性 。这些 发现 为新型抗 菌疗 法提 供 了广阔前景 。 ２ ． ３ 利用秀 丽隐杆线 虫感染模 型研 究新型抗茵药物作 用机 制 减 弱 细 菌 的毒 力 是 抗 菌药 物 的 研 发 的一 个 靶 点 ， Ｈ ｏ
菌 ， 革兰 阴性菌铜绿假单胞菌
、 沙 门菌 ¨ 等。
耐药铜绿假 单 胞菌 （ ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ） 是 常 见 的 院内感染致病菌 。通过 制备耐药 铜绿假 单胞菌 感染 秀丽 隐
秀丽隐杆线 虫可以通过检测并且识别 Ｔ ｏ ｘ Ａ介导的翻译抑制
染。
杆线虫平板 ， 周雨朦等 建立 线虫 一耐 药铜绿 假单 胞菌感
染模 型 ， 并且在感染线虫救治实验中发现 ， 可 以排 除毒性 高 、
体 内外相关性差 的化合物 ， 线虫感染 模型适合用于筛选抑制
耐药菌生长和繁殖 的化合物 。陈丽红 等 建立 了铜绿假单 胞菌 一 线 虫感染模 型 ， 确 立 了最佳 操作参 数 ， 并且研 究 了不 同抗 生素对线虫存 活时间的影 响 ， 得 出了线虫感染程度 可量
２ ． ２ 利用秀丽隐杆线虫感染模型研究细菌致病机制和 线虫
免疫机 制 早 期研究 中， Ｇ ａ ￣ｉ ｎ等 采 用线虫 作为 宿 主模
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用周雨朦;陈代杰【摘要】秀丽隐杆线虫在药物和靶蛋白筛选方面越来越受到药物学家的重视,已形成了较为完善的药物筛选技术平台.本文以新药的发现为目标,介绍线虫作为新药筛选模型的特点、研究现状及该模型在新药发现中的应用.【期刊名称】《上海医药》【年(卷),期】2011(032)011【总页数】6页(P566-571)【关键词】秀丽隐杆线虫;模型;药物筛选;药靶筛选【作者】周雨朦;陈代杰【作者单位】中国医药工业研究总院上海医药工业研究院,创新药物与制药工艺国家重点实验室,上海,200040;中国医药工业研究总院上海医药工业研究院,创新药物与制药工艺国家重点实验室,上海,200040【正文语种】中文生物学界对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的研究始于20世纪60年代。
英国科学家Brenner [1]选择了线虫作为确定完整神经系统的较为简单的生物模型。
随后，Sulston经过20年的努力，到20世纪90年代中期构建了完整的线虫细胞谱系图，使线虫成为唯一一个身体中所有细胞能被逐个盘点并归类的生物。
Horvitz利用遗传突变和基因克隆等手段，揭示了线虫细胞程序性死亡的遗传调控机制，并证明相应的调节基因在高等动物和人体中也存在。
这三位科学家的研究对生命科学领域做出了极为重要的贡献，于2002年分享了诺贝尔生理或医学奖[2]，使秀丽隐杆线虫成为当代生命科学和医学研究中最重要的模式生物之一。
近年来，秀丽隐杆线虫在药物或靶蛋白筛选方面越来越受到药物学家的青睐，已形成了较为完善的药物筛选技术平台。
本文从药物研发的角度讨论线虫作为模式生物的特点，以及目前利用秀丽隐杆线虫建立的疾病模型在新药发现中的应用。
1 秀丽隐杆线虫整体生物模型的特点秀丽隐杆线虫属于线形动物门线虫纲动物，结构如图1[3]所示。
利用秀丽隐杆线虫整体生物能够建立和模拟与人类疾病相关的模型、筛选不同的新型活性物质并发现新颖生物功能的靶点或靶标，实现这些目标的基础主要在于以下两个方面。
实验报告：线虫RNA干扰的基因沉默
实验报告：线⾍RNA⼲扰的基因沉默实验⼀：线⾍RNA⼲扰的基因沉默⼀、实验⽬的RNA⼲扰（RNA interference,RNAi）是⼀种使基因使失活的有效⽅法，在线⾍中，RNA⼲扰因为简单⽽成为研究基因功能的有效⼿段。
我们利⽤表达tag-214 dsRNA的⼤肠杆菌喂⾷线⾍来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的⽬的。
⼆、实验背景RNAi是近年来以秀丽线⾍的研究为基础⽽发展起来的⼀种基因knock down 技术，将体外合成的含有⽬的基因的dsRNA通过某种⽅式引⼊到线⾍体内，导致其体内相应的⽬的基因mRNA降解，从⽽达到基因沉默的⽬的。
三、实验原理通过显微注射dsRNA或者把线⾍浸⼊到含有dsRNA的溶液中，或者⽤能够表达dsRNA的⼤肠杆菌喂⾷线⾍，可以将dsRNA导⼊⼤肠杆菌中。
在⼤肠杆菌HT115中，含有⽬的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退⽕形成dsRNA。
当线⾍以此⼤肠杆菌为⾷时，就摄取了⼤肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线⾍体内RNA⼲扰的发⽣。
本实验将利⽤表达tag-214 dsRNA的⼤肠杆菌喂⾷线⾍来介导RNAi，以达到鉴定tag-214基因功能的⽬的。
四、实验材料：1.秀丽线⾍（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）由于线⾍的RNA的⼲扰操作简单快速，且重复性好，已成为鉴定基因功能以及基因间互相作⽤关系的有效材料。
秀丽线⾍属于线性动物门，线⾍纲，⼩杆线⾍⽬，⼴杆线⾍属。
秀丽线⾍是⼀种⽣活在⼟壤中的线⾍，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。
秀丽线⾍具有雌雄同体和雄性个体两种性别。
雌雄同体的线⾍有两条X染⾊体和5对常染⾊体。
其基因组⼤⼩为80Mb，包含13000个基因。
如上左图为秀丽线⾍的模式图（上为雌雄同体，下为雄性个体），右图为秀丽线⾍的⽣活史。
线⾍具有⽣活周期短，易培养和保存等优点，由于其⾝体透明，因此可以在显微镜下跟踪观察每个细胞的命运，是⽬前遗传学、发育学和细胞⽣物学研究的重要模式⽣物。
浅析秀丽隐杆线虫被大量用于筛选抗衰老药物的原因和相关实验步骤
浅析秀丽隐杆线虫被大量用于筛选抗衰老药物的原因和相关实验步骤作者：彭宇昀来源：《健康前沿》2019年第04期摘要：秀丽隐杆线虫是研究老化现象的重要模型生物，已经使用了近40年，在对具有延缓衰老作用的相關药物进行初步筛选方面具有重大贡献。
本文通过对有关文献和实验进行分析，就秀丽隐杆线虫被大量应用于筛选抗衰老化合物的原因和有关实验展开研究，分析利用秀丽隐杆线虫进行抗衰老药物筛选的优点，总结相关实验步骤，得出秀丽隐杆线虫细胞数目固定，与人类基因同源性较高且易养殖是其用于进行药物筛选的重要原因。
总结出进行实验时需要充分考虑，排除如待测的相关药物对OP50菌液的抑制性等无关变量对实验结果的影响。
关键词：秀丽隐杆线虫，抗衰老，筛选，原因秀丽隐杆线虫作为模式生物在生命科学的各项研究中使用广泛，大量运用于抗衰老药物的筛选。
[1]近年来，有研究提出诸如阿司匹林，二甲双胍等常用药物成分具有延缓人体衰老的功能，而秀丽隐杆线虫在对这类化合物的筛选过程中起了重要作用。
本文将探究秀丽隐杆线虫被广泛应用于抗衰老化合物筛选的原因。
1 原因分析1.1自身原因1.1.1 细胞数量固定经研究发现，秀丽隐杆线虫在其幼虫时期有556个体细胞和2个原始生殖细胞。
秀丽隐杆线虫的成虫可分为：雄性个体和雌雄同体个体两类，其中雄性成熟个体有1031个体细胞和1000个生殖细胞，雌雄同体成熟个体含有959个体细胞和2000个生殖细胞。
固定的细胞数量使研究人员可以更容易对比不同化合物的作用下，同种细胞在不同个体中在药物作用下的具体变化，减少无关变量的产生，使不同个体（如：用抗衰老药物处理和不用抗衰老药物处理的个体）的同种细胞之间差异性的比较更具有说服力。
同时，可以更好的探究药物在具体细胞中的作用方式、具体效果，探究对应化合物具有抗衰老作用的原因。
1.1.2 生殖能力强，雌雄同体相关文献表明，当秀丽隐杆线虫的雌雄同体成熟个体自体受精时可产生200～300颗卵，而雄性成熟个体与雌雄同体成熟个体交配，发生异体受精时可以产生1000多颗卵。
(完整word版)秀丽隐杆线虫综述
秀丽隐杆线虫综述摘要：随着生命科学研究的不断深入，模式生物的重要性也在不断的体现出来，秀丽隐杆线虫就是其中一种非常重要的生物.对秀丽隐杆线虫的特征、研究进展及未来发展方向进行简要的综述.关键词：秀丽隐杆线虫；研究；前景在20世纪60年代中期S。
Brenner为了研究动物的发育和神经，领先选择了以秀丽隐杆线虫为研究的实验动物[1］。
现今，秀丽隐杆线虫已经成为当今生物学家研究细胞代谢与细胞生长、分化、衰老、凋亡等生命活动的协同与调节机制的重要模式生物之一.1.秀丽隐杆线虫的生物学特征在1998年作为人类基因组测序的一个项目，秀丽隐杆线虫的全部序列完成测定，基因组序列全长9.7×104kb，大约编码19000个基因,其中约有40%的基因与人类的相似［2].其成虫体长约为1mm，由959个体细胞组成.其胚胎发育过程中的细胞分裂分化以及细胞的的衰老凋亡都具有高度的程序性，便于对其进行遗传学的分析。
由于上述原因，秀丽隐杆线虫已经成为现代发育遗传学、遗传学、细胞生物学研究的重要模式生物。
为人类认识细胞打开了一扇新的大门.秀丽隐杆线虫在性成熟之后能够产下三百到三百五十左右的各种各样表型的幼虫。
从卵到成虫只有3.5d，寿命约2~3周，非常适合实验室进行生物学研究。
在发育过程中，秀丽隐杆线虫共生成1090个细胞,其中131个将会死亡，所以，野生型秀丽隐杆线虫成虫有959个细胞，并且每个细胞的位置固定不变。
秀丽隐杆线虫有5对常染色体和1 对性染色体。
它有两种性别:雌雄同体和雄性。
雌雄同体可以自我繁殖,也可以与雄性交配繁殖.自我繁殖的大多是雌雄同体，与雄性交配的后代,50%是雌雄同体,50％是雄性。
可以人为控制繁殖方式，获得理想表型。
秀丽隐杆线虫的突变体非常之多，很多突变体表现出的性状在显微镜下都是清晰易见的。
秀丽隐杆线虫低温冷冻保存的技术，可以将大量野生型、突变型的秀丽隐杆线虫品系保存起来[3］.1988 年,人们对秀丽隐杆线虫每个细胞的起源已经完全清楚,使得在多细胞生命体内研究一个完整无缺的单个细胞的发育和形态成为现实，对确定基因如何影响细胞的发育提供了一个重要的研究工具[4]。
线虫致病基因的筛选与功能分析研究
线虫致病基因的筛选与功能分析研究线虫是一种微小的多细胞生物，拥有优越的生殖能力和短时间内快速繁殖的特点，成为许多研究领域中的常用模式生物之一。
在这些领域中，其中一个最为热门的话题就是线虫的致病性基因。
这些基因与线虫疾病的形成息息相关。
本文将从筛选致病基因这一方面来探讨线虫致病基因的研究与功能分析。
一、“文库筛选”法线虫有近100,000个基因，其中一小部分与疾病相关。
早期的线虫致病性基因筛选方法是文库筛选。
它通常将病原菌感染线虫之后，将感染后的线虫基因组中的DNA挑选出来并参杂入向酵母菌发酵后的文库，这样就得到了一个“文库”，其中包含了大量的不同基因序列。
然后，将文库中的基因序列引入线虫细胞，筛选出可能与致病性相关的基因。
但这种方法存在许多局限性。
传统文库筛选需要使用大酒精平板（70%-90%的甲醇），这极易引起蒸发，从而导致筛选条件发生变化，影响筛选方案的实施。
此外，由于大酒精平板存在毒性，所以文库筛选也会通过不可靠的筛选结果和巨大的基因库造成不必要的浪费。
二、“RNAi”筛选法因此，寻找一种相同或更具有优越性质的筛选方法是必不可少的。
目前线虫致病性基因筛选的常用技术是RNAi筛选法。
RNA干扰(RNAi)是一种基于RNA的近纯物质的基因敲除技术。
这种方法可以非常灵活地使用不同的载体建立siRNA文库。
siRNA被注入到线虫的胃部，其目的是将siRNA引入到细胞内，达到抑制胚胎发育或成体基因转录的效果。
首先，线虫与其他生物一样有自身的RNAi机制，即线虫的RNAi(brother in RNAi)现象。
因此，无论是内源性siRNA文库（即线虫产生的siRNA，该文库中含有许多可以控制胚胎发育、细胞周期，甚至DNA修复等功能的基因）还是外源性siRNA文库（在人工合成siRNA后，一直到siRNA文库内的那些人工合成siRNA），线虫都能进行RNAi反应，并且许多相关的siRNA文库逐渐被建立。
秀丽隐杆线虫研究情况
秀丽隐杆线虫研究情况
秀丽隐杆线虫被应用于实验研究至今已逾30年，因为易于实验室培养、基因易处理、解剖学结构简单以及可以提供广泛的遗传学和基因组信息，已成为一种重要的研究细菌和真菌的哺乳动物替代模型。
与黑腹果蝇一样，秀丽隐杆线虫将天然免疫作为防御微生物感染的唯一防线。
Mylonakis等研究发现，一些对哺乳动物起作用的新生隐球菌毒力因子在杀死秀丽隐杆线虫的过程中同样有效，这些基因包括信号转导途径GPA1、PKA1、PKR1、 RAS1和漆酶等；而那些对哺乳动物毒力较低的因子在秀丽隐杆线虫模型中致病性亦较弱。
还有作者通过秀丽隐杆线虫模型研究荚膜、黑色素、调节通路等毒力因子来鉴定毒力减低的新生隐球菌，结果发现rom2基因突变的隐球菌在37℃时失去繁殖及生长的能力，并无法生成细胞壁和难耐高渗。
多数秀丽隐杆线虫是可以自身繁殖的雌雄同体动物，偶尔也可见到雄性单体。
实验结果证实野生雄性线虫较雌雄同体线虫对真菌的抵抗力增强，而且这种抵抗力的增强归因于应激反应激活因子DAF-16的参与，而不是由于行为或生殖方式的不同。
基因治疗中的基因敲除筛选与验证方法
基因治疗中的基因敲除筛选与验证方法基因治疗是近年来快速发展的一项前沿技术，它通过修复或替代异常基因以治疗遗传性疾病和其他疾病。
基因治疗中的一个重要步骤是基因敲除筛选与验证方法，它可以帮助研究人员确定目标基因，并确保敲除的准确性和有效性。
本文将讨论基因治疗中常用的基因敲除筛选与验证方法。
一、CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是目前最常用的基因敲除方法之一。
该系统利用一种特殊的RNA分子（CRISPR RNA），与一种酶（Cas9）结合，形成一种RNA-蛋白复合体。
这个复合体通过与目标基因的DNA序列匹配，以导致双链断裂。
当细胞试图修复这个断裂时，往往会引起基因突变或插入/缺失等错误修复，最终导致目标基因的敲除。
CRISPR/Cas9系统具有准确、高效和简便的优点，因此被广泛应用于基因治疗中的基因敲除。
研究人员可以通过合成适当的CRISPR RNA和Cas9蛋白，将其导入细胞，并使用基因编辑技术检测目标基因是否被成功敲除。
二、RNA干扰（RNAi）技术RNA干扰技术是另一种常用的基因敲除筛选方法。
该技术利用小干扰RNA （siRNA）或小发夹RNA（shRNA），通过与目标基因的mRNA相结合，引导RNA酶复合物切割目标mRNA，从而降低或抑制该基因表达。
使用RNA干扰技术进行基因敲除筛选具有一定的优势。
首先，该技术广泛适用于多种细胞类型和体外和体内实验。
其次，通过设计合适的siRNA或shRNA，可以选择靶向特定基因的序列，以实现高度特异性的基因敲除。
三、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种常用的基因敲除验证方法。
该方法通过首先将mRNA转录为互补DNA（cDNA），然后使用特定引物进行PCR扩增。
最终，扩增产物可以通过凝胶电泳和测序技术来确定是否成功敲除了目标基因。
RT-PCR在基因敲除验证中的作用非常重要。
通过检测cDNA的存在与否，研究人员可以确定目标基因是否成功敲除，并进一步评估其在细胞和组织中的表达水平。
SEC-10在秀丽线虫胞吞途径中的功能研究
SEC-10在秀丽线虫胞吞途径中的功能研究囊泡运输是细胞生命活动的基础,是各种生理活动正常运行的保障,与许多疾病的发生密切相关。
根据目的地不同,囊泡运输可分为胞吐途径和胞吞途径,涉及到囊泡与胞内细胞器以及质膜的直接作用,为胞内复杂的分子网络所调控。
当前对囊泡运输的研究已经确认了许多起调控作用的蛋白分子,但某些调控蛋白的具体作用位点和分子机制尚不清楚。
本文利用来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的PC12细胞和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)分别对胞吐和胞吞途径中的重要调控蛋白SynaptotagminⅦ(SytⅦ)和SEC-10的作用机制做了进一步的研究,特别是在秀丽线虫中的工作克服了传代细胞不能直接联系生物体表型和行为的缺点,在活体中比较了不同类型细胞里SEC-10的胞吞机制差异,揭示了exocyst在胞吞途径中新的作用。
在培养的PC12细胞中研究了SytⅦ对致密核心囊泡(DCVs)胞吐过程的影响。
SytⅦ因其具有比SytⅠ和SytⅨ更高的钙离子亲和力,以及在与脂质结合后表现出更慢的解离动力学过程,被认为在DCVs分泌的慢速动力学过程中起着钙离子感受器的作用,而并不参与突触囊泡的快速分泌过程。
但迄今为止,SytⅦ的亚细胞定位及其生理学功能仍未完全清楚。
我们首先应用全内反射荧光显微镜技术表明,在PC12细胞中SytⅦ定位于DCVs;又通过综合运用高时间分辨率的细胞膜电容测量和碳纤维微电极安培检测,确定了单独沉默内源性的SytⅦ就可以明显减少PC12细胞中钙触发的DCVs与质膜的融合并抑制了融合孔的开放,特别是减少了DCVs胞吐触发相的幅值,而对于其持续成分的速率则几乎没有影响。
这些发现提示我们SytⅦ在PC12细胞DCVs融合机制中作为钙感受器,对可释放DCVs库的形成和维持起着非常重要的作用。
本文的主要工作为在模式生物秀丽隐杆线虫中研究了SEC-10对于线虫整体行为以及各种生命表征正常维持的重要性,特别是在不同的胞吞模型细胞中,较为深入细致地研究了SEC-10对细胞内吞及内吞后的胞内运输的调控功能,并探索其可能的分子机制。
SEC-10在秀丽线虫逆行行为中功能的研究
SEC-10在秀丽线虫逆行行为中功能的研究李江丽;张蓉颖【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2010(14)4【摘要】秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是一种研究行为和神经系统相互关系的良好的模式生物,可以在实验条件下给予它物理、化学等多种外部刺激,也可以在分子水平改变其基因结构以改变线虫的行为方式,从而进一步研究神经系统中与行为相关的分子机制.以sec-10突变为遗传背景,采用一种秀丽线虫逆行行为的简单测定方式,研究发现sec-10突变导致线虫逆行动作增多,初步探讨了在突变体线虫的神经系统中重新表达野生型SEC-10可以回复该逆行行为缺陷.【总页数】5页(P294-298)【作者】李江丽;张蓉颖【作者单位】华中科技大学,生命科学与技术学院,中国湖北,武汉,430074;华中科技大学,生命科学与技术学院,中国湖北,武汉,430074【正文语种】中文【中图分类】Q189【相关文献】1.酿酒酵母中响应线粒体功能障碍的逆行响应(RTG)途径的研究进展 [J], 闫洪波2.内镜下胆胰管逆行造影、T管会师术在十二指肠乳头括约肌功能紊乱诊治中的应用研究 [J], 杨世杰;杨勇;黄允宁;杜鹏;丁向英;兰银霞3.秀丽线虫基因敲除突变库中sec-10突变种系的筛选 [J], 李江丽;张蓉颖4.空间环境对秀丽线虫行为及生长发育研究进展 [J], 赵苒;高振洪;卢卫红5.自研手多功能支具在手部皮肤逆行撕脱伤康复治疗中的应用研究 [J], WANG Zhao-hui;GAO Jun-qing;ZHANG Jia-sheng;FU Ji-le;YAGN Song;LUO Hua-jie;ZHAN Xiao-huan因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SEC-10在线虫细胞转运途径中的功能研究
SEC-10在线虫细胞转运途径中的功能研究Exocyst复合物是由SEC-3, SEC-5, SEC-6, SEC-8, SEC-10, SEC-15, EXO-70和EXO-84共8种亚基蛋白组成一种蛋白质复合物,它在细胞内物质的转运中起着重要的作用。
目前人们认为exocyst复合物主要作用于囊泡和膜结构融合之前的栓系(tethering)过程,以及囊泡从高尔基体分泌之后被转运到膜附近的过程,但是对于其具体分子机制尚无法完全阐明。
此外还有报道exocyst复合物的蛋白组分SEC-5, SEC-8在胞吞中行使功能。
为了更加清晰的了解exocyst复合物的作用机理,以及探寻该复合物是否还存在其他未知的功能,我们针对exocyst复合物的蛋白组分SEC-10开展了研究。
线虫作为模式生物在诸多方面存在着不可比拟的优势,所以我们选取它作为研究的平台。
我们首先构建完成了国内首个高通量线虫突变基因库,通过对该突变基因库进行筛选,我们成功得到sec-10基因突变的线虫种系。
我们发现sec-10基因的缺失引起了线虫的多种缺陷表型,而且sec-10基因也广泛地在线虫体内表达。
我们分别针对了神经肌肉接头处的信号传递,腔胞的胞吞以及产卵这三个方面进行了研究。
神经肌肉接头处的电生理数据显示sec-10基因的缺失对于目前已经报道过的突触后三种离子型受体均不存在影响,而且也未干扰突触前的囊泡自发性分泌。
但是药学实验的结果却能够推论出sec-10基因突变种系的突触后膜上受体过度敏感,我们推测是由于突触后膜上离子型受体以外的其他类型受体受到了影响。
通过GFP吸收实验,我们发现sec-10基因突变种系的腔胞存在明显的胞吞缺陷,而肌肉分泌GFP完全正常,成像结果显示sec-10基因的缺失严重影响了Clathrin依赖的胞吞途径相关分子的定位和形态,但是sec-10基因突变种系的腔胞中早期内涵体,晚期内涵体,溶酶体以及高尔基体的形态和分布均正常,而且rhodamin-dextran在胞内的定位也和野生型基本一致,因此推测该突变体Clathrin依赖的胞吞途径受阻,而腔胞内转运过程未产生明显改变。
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１ 材 料 与 方 法
１ １ 酶 和试剂 ． Ｔｑ酶 （ａ Ｃ ｓ ｒ ｘＴＡ Ｇ ＮＫＴ ０）单虫裂 解液 ： ｓｐ ８０３ ｌＬ ａ ＴｑＰ Ｒ Ｍａｔ ， ＩＮ Ｅ ２１． ｅ Ｍｉ 商 Ｈ ．，Ｏｍｍｏ ； ／ Ｅ Ｔ ８ｍｍ ｌＩＮａ ｉ０ｍｎ ｌＬＮ ４ ． ９；ｗ ｅ２ ． ． 白酶 Ｋ，０ｒ ／ ， ｅ￣￣ｇ． Ｄ Ａ ｏ／ ａ ０ ＇ ／ ；Ｐ ００７／Ｔ ｅｎ ００７ 蛋 ； ￣ ６ １ ｇｍＥ － ０ ａ Ｃ
许不 同遗传 背景 的线 虫进行 遗传 交配 ， 而且也 可 以仅 以雌雄 同体 的形 式传 代 从 而保 持 其单 纯 的遗 传 背 景 ， 一点使 其在遗 传研究 上具 有其他 模式 动物无 可 比拟 的优势 ． 这 基 因敲 除是线虫 研究 过程 中的重 要 技术 之 一 ， 即通 过分 子 操作 改 变 生 物体 内某 已知 基 因 的 Ｄ ＮＡ 序列 ， 基 因进 行完 全或不 完全 的去除致 使其 功能丧 失 ， 对 以便 对 目的基 因在生 物体 内的功 能 开展进 一 步
基 因组序列 及其具 有约 ４ 与 人类 基 因组 同源 的基 因 ， 因为 它 具备 作 为模 式 动 物 所 必需 的多 个 特 ０ 还 征 ： 养方便 廉价 ； 饲 可像其 他动 物细胞 一样在 － ８ ０℃保存 ； 长周期 短 ， 生 传代 快 ； 体小 ， 体透 明 ， 通 易于 在 显微镜 下对 活体组织 和细胞 进行 跟踪 观察． 外 ， 此 由于具 有 雄性 和 雌 雄 同体 两种 性 别特 征 ， 仅 可 以允 不
收稿 日期 ：２ ０ —１ —０ ０９ １ ７ 基金 项 目 ：国家 自然 科 学 基金 （０ ０ １ ７ 资 助 ３５０１）
作者简介 ： 李江丽 （９ １ ）女 ， １８ 一 ， 博士生 ； 张蓉颖 ， 通信作者， ｍａ ：ｙｈ ｎ ＠ｍａ． ｕｔｅｕ ｃ Ｅ ｉ ｒｚａ ｇ ｌ ｉ ｈ ｓ．ｄ ． ｎ ｌ
行 杂交 获得双 突变甚 至多 突变 的种系 ， 以便进 行多个 蛋 白质相 互作 用 的研 究 ． 因此 ， 作为 一 个经 典 的反
向遗传方法， 基因敲除技术依然保持着其无可取代的地位．
本文中以我们实验室构建 的线 虫基 因突变库 为对 象 ， 在简单 描述基 本原理 的基础上 ， 将前 人 的研 究方
第 ３ 期
李江丽等 ： 秀丽线虫基 因敲除突变库 中 ｓ￣ Ｏ突变种系 的筛选 ｅｌ
行分子机制的研究 ， 是研究不 同基 因及其蛋 白产物作用机制 的一项基 本技术． ｓ￣ Ｏ突变种 系的成功筛 选 以 ｅｌ
为例 ， 详细描述如何通过 Ｐ Ｒ检测方法从 笔者实 验室所构建的 国内第一个秀丽线虫基 因敲除 突变库 （ Ｃ 可进 行
多 达 几百 次 的筛 选 量 ） 中筛 选 出 目的 基 因 的 突 变种 系 ， 时 证 明 突变 库 的可 用 性 ． 据 ｓ ｌ 同 根 ｅ Ｏ基 因 序 列 设 计 多 ｅ
第３ 第３ ２卷 期
２ １ 年 ９月 ００
湖北大学学报（ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＨ ｕ ｅ Ｕｎｖ ｒｉｙ Ｎａｕ ａ ｃｅ ｃ ） ｏ ｒ ａ ｂ ｉ ｉｅｓｔ （ ｔ ｒｌ ｉｎ ｅ ｏ Ｓ
Ｖｏ１ ２ Ｎ ｏ ．３ ．３ Ｓｅ ．，２ ０ ｐ ０１
文章 编 号 ：０ ０ ３ ５ ２ １ ）３ ３８— ５ １０ —２ ７ （０ ０ ０ —０ １ ０
秀 丽 线 虫基 因敲 除 突 变 库 中 ｓｅ Ｏ突 变 种 系 的筛 选 ｅ－ ｌ
李江 丽， 张蓉 颖
（ 华中科技大学 生命科学与技术学院 ， 湖北 武汉 ４ ０ ７ ） ３ ０ ４
摘 要 ： 秀 丽 隐杆 线虫 （ ａ ｎｒａｄ ｔ ｅａ ｓ 的基 因 突 变 库 中 筛 选 出 目的 基 因 的 突 变 种 系 ， 对 其 进 从 Ｃ ｅｏｈ ｂ ｉ ｓ ｌ ｎ ） ｉｅ ｇ 并
法［和我们 自己的实验经验相结合 ， ３ ］ 介绍从线虫库 中筛选 目的基 因的方法 ， ｓ－Ｏ为例 ， 以 ｅｌ ｃ 总结 了该过程的实
验技巧和可能 出现的问题 以及相应 的解决策略． 线虫 中的 ｓ － ｅｌ ｃ Ｏ与人 的 ｓｃ Ｏ蛋 白有着高达 ３ 的序列相似 ｅｌ ￣ ７ 性［ ， ４ 是高度保守的蛋 白质复合体 ｅｏｙｔ ］ ｘｃｓ 的八组分之 一， 在分泌途径中起着囊泡栓 系的作用 ］ ．
套针对不 同靶点 的含干扰引物的巢式 引物 ， 通过凝胶 电泳正确判断扩增产物的特异性 和干扰 引物对长 片段 产 物的抑制特性 ， 以选择有效 的检测引物． 简化 了线虫复苏后 的饲养 方法 ， 以取代恒温恒湿 培养箱 的使 用． 过 通 纯和致死平衡子 的引入 ， 克服 了 ｓｅ Ｏ基 因突变致死所导致 的无 法稳 定传代 的问题． ｅｌ 总结 了从 秀丽线虫基 因
突变库 中筛选 突变种系 的注意要点 ， 国内其它线 虫基 因突变库 的筛选提供重要的参考 意见 ． 为
关键 词 ： 丽 隐杆 线 虫 ；基 因 敲 除 ；筛 选 ； Ｃ 秀 Ｐ Ｒ检 测 ；ｓ ｌ ｅ Ｏ ￣标 志 码 ： Ａ
模 式生 物秀丽 隐杆线 虫在生 命科 学研究 中发挥 着举 足轻 重 的作 用． 这不 仅 由于其 已经被 解析 的全
研 究 ＿ ｊ通 过基 因敲 除可 以得 到遗传 背景 中完 全 没有 目的基 因表 达 产 物 的突 变种 系 ， 服 了 Ｒ １． 克 ＮＡｉ 过
程 中有 残余 蛋 白质 作 用 的缺 陷 ； 于 改 变 了 基 因 组 序 列 ， 除 所 得 的 突 变 可 以无 限遗 传 ， 不 同 于 由 敲 而 Ｒ ＮＡｉ 技术 的瞬 时干扰 ； 通过 基 因敲除得 到 的特 定基 因 的突变 体 线虫 可 以和 其 他基 因的 突 变体 线 虫 进