免疫组化及特殊染色_图文.

第13章免疫组织化学技术(共42张PPT)

➢ 电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点
免疫胶体铁细胞化学染色法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探针。图像清晰，可动态观察活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法
第五节免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌绿色-活菌红色-死菌酶免疫组织化学技术的应用

免疫组织化学染色技术演示文稿

以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为 -D- 葡萄糖 67mg 、 NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、
0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37ºC孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。
同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原
异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原
第8页，共92页。
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋
巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。
大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序
1抗孵育切片或细胞涂片
2抗（酶标抗体）孵育切
片发色剂显色（核复染）
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（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
HRP + H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
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尸检组织
由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同程度自溶，其抗原或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸检一般多在24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响严重，而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。

免疫组化染色原理

免疫组化染⾊原理⼀、项⽬介绍免疫组织化学IHC。

肿瘤⼀般流程，做HE常规染⾊，确认后进⾏针对性IHC检测分析。

不同项⽬的染⾊位置不同，分为：核染，膜染和浆染。

⼆、乳腺癌案例三种成因，对应三种检测对象：1.Her2，可采⽤罗⽒靶向治疗药物赫塞丁针对性治疗。

2.ER，主要因激素等原因导致的乳腺癌，术后通过调节内分泌有效治疗⽅法。

3.PR，主要因激素等原因导致的乳腺癌，术后通过调节内分泌有效治疗⽅法。

4. 三阴，以上三种测试结果均为阴性的肿瘤，原因不详，可能与转移有关，严重程度⾼。

三、检测流程1. 术后标本⾸先通过甲醛浸泡脱⽔，两⽅⾯：1.1 防⽌细菌滋⽣使标本腐烂1.2 防⽌组织细胞内酶渗透出细胞壁，破坏细胞形态。

2. 包埋，将标本⽤蜡包埋，便于保存和切割。

3. 切⽚，将组织切⽚，2~3微⽶，⽤于测试。

3.1 切⽚机包含⼿动和⾃动，⼿动切⽚机内部通过钢丝绕线，⼿动转动过程进⾏拉伸。

提供2~5微⽶调节旋钮。

3.2 ⾃动切⽚机，原理不详，不排除齿轮⽅案。

只提供特定厚度切换。

4. 上机脱蜡，由于蜡侵⼊组织，反应试剂⽆法进⼊，因此必须先脱蜡后才能反应。

4.1 设置温度80度。

4.2 4分钟清洗⼀次，清洗过程为：加-吹-加。

4.3 由于溶解蜡的液体性能⼀般，需要多次清洗。

5. 抗原修复，甲醛固定时会将位点粘连，导致⽆法与⼀抗结合，因此需要将位点打开，使⽤抗原修复液⾼温修复。

5.1 ⾼压锅⽅案温度达到121度左右，⼿⼯常规⽅式。

5.2 ⼀般采⽤三种⽅式修复：化学⽅法，微波⽅法和加热⽅法。

设备采⽤化学（抗原修复液和加热组合⽅式）5.3 上机95摄⽒度⽅案同121度⽅案偏差不⼤。

5.4 ⼲⽚问题，如果出现⼲⽚，容易导致组织皱缩，影响最后的组织观察。

5.5 ER种类包括三种：PBS（缓冲液，ph7，磷酸盐成分，容易结晶且难以去除，可使⽤84消毒液或冰⼄酸溶解，容易使长菌，5天左右可出现蓝-藻类、深⾊半点-霉菌）、CBS（ER1，ph6）、EDTA（ER2，ph9）6. 添加ER过程中需要补液，由于抗原修复液中含有⽔和特殊物质，⽔沸点低，补液过程特殊物质浓度逐渐增加且残留在玻⽚上，因此需要pbs进⾏单独清洗。

免疫组化课件PPT课件

李
三华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室李三华
二免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP；石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。（6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验室李三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心实验室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其

免疫组化方法学课件

和最低背景着色
抗体稀释度特异性染色背景着色 1:50 +++ + 1:100 +++ + 1:200 1:400 +++ － + －阴性对照－－
（4）孵育时间，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体。一般采用37℃ 1h，或4℃ 过夜
6. 二抗选用和稀释度 ⑴ 二抗常采用羊或其他动物，关键决定一抗的动物
免疫组化应用一抗大多属IgG型抗体，而IgG作为抗原时其特异性位点在重链FC段。
2) 免疫球蛋白化学结构
抗原抗体的结合就像酶与底物结合、激素与受体结合，不是化学反应而是非共价键可逆性结合（Ig的抗原结合点由L和H链可变区组成，与相应抗原上的决定族互补，借助静电力、氢键、范德华力等次级链相结合）并受pH，温度和电解质浓度影响。
肾内源性生物素染色假阳性
肝内源性生物素染色假阳性
2.消除非特异性背景着色
滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液以封
闭荷电点，不给一抗留有吸附余地。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
采用二抗的同种动物的非免疫血清
多克隆抗体成分复杂，易产生背景染色，稀释液中
采用含1%BSA的 pH7.4 PBS(加0.05%NaN3防腐)，
在洗涤液中加入0.03%吐温20对消除背景也有帮助。
1. 抗原（antigen, Ag）
1) 免疫原性
2) 免疫反应性 3) 抗原分类结构抗原细胞骨架蛋白（中间丝）、癌基因及抗癌基因蛋白产物入侵抗原病原微生物如：HPV、HBV等分泌抗原酶、激素、粘液蛋白沉积抗原免疫球蛋白、补体、免疫复合物

免疫组化及特殊染色概要

抗原是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性
与人类有关的抗原

ห้องสมุดไป่ตู้

病原微生物在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防接种，可以提高人的免疫力。嗜异性抗原一类与种属特异性无关的、存在于人以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。肿瘤抗原由物理的、化学的因素或某些病毒诱发的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤中心存在着与病毒密切相关的抗原。同种异体抗原动物免疫血清
Plasma Membrane + PER・Golgi
Plasma membrane
PER + Golgi
Golgi apparatus
Endocrine granule
CEA EMA ALP CD10
SC EGFR E-cad
IHC方法
3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法：使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗原。
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES） H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗
识别系统
免疫组织化学
联结系统
显示系统

识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。

IPP 分析免疫组化图片(共61张PPT)

民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面貌，而且它对每一张照片都使用了不同的拍摄条件。严重影响照片的分析测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。
各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证它们的曝光一致。
控制相机曝光时间
要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。
拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过高。
在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。
使用IPP比前两种方法更好。
IODdensi(txy, y)ds 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。
右上角的空白区面积应该扣除。整张图片所有对象的IOD累加值（IOD SUM）
所以最后的分析测量结果依然属于半定量分析。
1.6
1.2
0.8 显著性
差异
0.4
0.2
0
阳性样品
0.1
阴性样品
1.2 1.1
1.0
背景
无显著性差异
背景+阳性样品背景+阴性样品
扣背景后依然没有显著性差异
阳性样品
阴1性.6样品
背景
1.2
阳性样品-背景
阳1性.2样品-背景
0.8
0.4
0
阳性样品
1.2
0.1
1.1
0.1
1 01..21 0.1