核酸的分离与分析

1. PCR反应模板 • （1）种类：可来自任何生物的单链或双链DNA，也可以是
用化学方法合成的。
• （2）数量：一般而言，PCR检测可以用纳克（ng）级的 DNA克隆模板或微克（μg）级的基因组DNA，或者是拷贝数 为105的目的DNA片段。
• （3）纯度：对样本纯度的最基本要求：一是要含有至少一 个包含有待扩增片段的完整的分子，二是其他的不纯物的 浓度不会抑制酶的活性。
DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若A样品的比值高 于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留 酚或蛋白质。
荧光分光光度法
• DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化 乙锭（EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外 线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与 核酸含量成正比。由此可建立标准曲线，测定未知 样品的浓度。
温度（℃） 94
循环1
94℃ 变 性 （ 1min）
循环2
72
60 60℃ 退 火 （ 1min）
室温下开始
72℃ 延 伸 （ 1.5min）
循 环 3… 时间（
• PCR扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过30次的循环反应， 便可使靶DNA得到109倍的扩增，但实际上大约是106~107倍 的扩增。
• 正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，意味着分子生物 学分析只需要含有痕量DNA的样品，包括一根头发、血迹 等。这对于法医学鉴定具有特别的应用价值。同时，应当 注意，任何DNA样品或实验试剂均应仔细避免发生污染， 确保实验结果的准确、可靠。
二、PCR反应体系与条件优化
标准的PCR反应体系： 50μl ~100μl体积，包括：模板DNA，底物（dNTP），Taq DNA 聚合酶（2.5U），2条引物（各0.25μmol/L），KCl（50 mmol/L），Tris·HCl（10 mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5 mmol/L），明胶或牛血清白蛋白（BSA）（1μg/ml）。
• DEAE纤维素膜插片法简便易行，回收率、纯度都很高，对回收 500bp~5kb左右大小的DNA片段效果很好。电泳洗脱法对大于5kb的DNA 片段较适合。冻融法、SDS溶液浸出法等方法都极为简便，但纯度与回 收率较差。
• 将低熔点琼脂糖挖块与玻璃奶法结合，可回收到质量较好的DNA片段。
第三节 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）
六、核酸的定量
• 核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。 • 常见的方法：紫外分光光度法、荧光分光光度法。
紫外分光光度法
• 核酸的最大吸收波长是260nm，吸收波谷在230nm。 • 根据测定，在波长260nm时，1 OD值的光密度相当于双链
DNA浓度为50μg／mL；单链DNA或RNA为40μg／mL；单链 寡核苷酸为20μg／mL。可以此来计算核酸样品的浓度，检 测最低限为0.5~1.0μg／mL。 • 通过测定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值来估计核酸 的纯度。
3. 底物（脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）浓度
• PCR反应中，dNTP浓度应在20~200μmol/L，高浓度dNTP可 加快反应速度，但同时会增加碱基的错误掺入率和实验成 本；低浓度dNTP虽会导致反应速度下降，但可提高实验的 精确性。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减少 错配误差。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注意 二者浓度之间的关系。
2. 细胞破碎——物理方法、化学方法、酶法等。 物理方法：超声波法、匀浆法、液氮破碎法等。 （注意：物理方法容易导致DNA链的断裂）
化学方法和酶法：去污剂（SDS 0.5%~1.25%）和溶菌酶或蛋白酶K温和 裂解。
EDTA（5mmol/L)作用：与Mg2+结合，抑制核酸水解酶.除去RNA，可加 入适量RNA酶。
美国Cetus公司科学家K.B.Mullis于1983年发明
• 概念: 在引物存在的条件下、以DNA为模板、由DNA聚合酶 催化的对特定基因或DNA序列进行体外快速扩增的反应， 故又称为基因的体外扩增法。
一、PCR技术的基本原理及特点
• 双链DNA分子在临近沸点的温度下便会分离成两条单链的 DNA分子，当温度降低时，DNA聚合酶以单链DNA为模板并 利用反应混合物中的引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs） 合成新生的DNA互补链。
2.煮沸法
利用DNA加热变性原理，结合不同DNA复性的差异进行 分离。复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在液相中， 通过高速离心（12,000 × g）可实现分离。
适于快速提取质粒 DNA并进行鉴定，也适用于大量提取， 对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。
3. CsCl-EB密度梯度平衡离心
二、核酸提取的主要步骤
1. 样品准备 2. 细胞破碎 3. 分离纯化核酸 4.核酸的沉淀浓缩
1. 样品准备 新鲜动植物组织材料：清洗、去掉杂质。少量样品可用液 氮冻结，然后快速碾磨成粉未状。 动物细胞：胰酶消化，离心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀 的细胞。 液体培养的微生物：直接离心沉淀收集菌体。
第二节 核酸的凝胶电泳
• 电泳：是利用带电荷物质的电场中的迁移速率的不同而将 其分离的方法。
• 凝胶电泳：利用了支持介质形成的网状结构使不同大小的 大分子物质得以分离并在保留于凝胶中，在不同位置形成 条带。
• 电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值（荷质 比）相关。
• 在中性pH或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷 酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极 向正极迁移。
CsCl是一种大分子量的重金属 盐，长时间超速离心时，在管中 形成1～1.8052g/cm3自上而下增 加的密度梯度。染色体DNA、质 粒DNA、RNA以及蛋白质等，可 在离心管内不同位置形成区带。 RNA可与Cs+结合，因此密度最大， 沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。
四、基因组DNA的制备
• 基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力 作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上 蛋白酶K温和裂解方法。
界面（絮状 蛋白质沉淀）
有机相（色 素、脂类、 糖类）
4.核酸的沉淀浓缩 乙醇沉淀法：无水乙醇结合核酸分子所结合的水， 使核酸沉淀。
微量的DNA，可加入中等浓度的单价阳离子促进 沉淀。如Na+，中和DNA分子上的负电荷，减少了 DNA分子间的同性电荷相斥力。
三、质粒DNA的分离纯化
• 重点考虑如何与基因组DNA相互分开。 ——利用质粒分子量小和闭合环状超螺旋结构性质。
• 在均一的凝胶网络中，核酸的迁移速率只与分子的 大小相关，使不同分子量者分开，而相同分子量聚 集形成条带。
一、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶作为电泳基质有如下优点：①形成的凝 胶具有大量微孔，其孔径尺寸取决于它的浓度，如 0.75%琼脂糖的孔径为800 nm，1%琼脂糖孔径为 150nm；②透明，无紫外吸收；③无毒，热熔冷凝， 制胶方便；④热可逆性，具有一定强度。
• 该凝胶孔径小、透明、弹性好、无紫 外吸收，可用于DNA、蛋白质等的分离。
聚丙烯酰胺 浓度（%）
3.5 5.0
8.0
有效分离范围 （bp）
100~1000 80~500
60~400
12.0
40~200
20.0
10~100
三、凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化
• 方法：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖 块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法等。
• 分离方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解 法、CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基 磷灰石柱层析法等。
1. 碱裂解法： 小量制备DNA较好的方法。
基本原理：在碱性pH（12-12.5）下，DNA分子均 变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分 开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能 准确复性而沉淀；质粒DNA分子因紧密缠绕在一起， 能准确复性而留于上清溶液中。
4. PCR反应的DNA聚合酶 • 100μl反应体系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量为0.5~5U。
根据扩增片段的长短及其复杂程度（G＋C含量）不同而有 所区别。
• 使用Taq DNA聚合酶浓度过高，会引起非特异产物的扩增； 浓度过低则合成产物量减少。
5. PCR反应的引物 （1）引物设计原则 • PCR引物通常长15~25碱基，其中G＋C约占50%。 • 引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。 • 引物的3’末端必须与目的片段完全相配。 • 引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序
3. 分离纯化核酸 关键步骤是去除蛋白质，还要避免核酸的降解。 酚/氯仿抽提法： 酚、氯仿: 两种不同的蛋白质变性剂。氯仿还能加速有机相
与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 异戊醇: 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
细胞破碎
酚/氯仿
细胞悬浮液
细胞抽提物
酚/氯仿提取除蛋白质原理示意图
水相 （DNA、 小 分 子 RNA ）
• 杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需 要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB）选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵 （TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。
五、RNA的提取
• 细胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分开，可先制得细 胞核、线粒体、核糖体等细胞器和细胞质，然后再从中分 离某一类RNA。
2.0
0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3
凝胶电泳成像图谱
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 （acrylamide，简称Acr）和交联剂
DNA在聚丙烯酰胺凝 胶中的有效分离范围
（crosslinker）N，N-甲叉双丙烯酰胺 （methylene-bisacrylamide，简称Bis） 交联成的三维网状结构的凝胶。
列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成。
（2）引物Tm
• 加热可以打开双链结构，当一半分子为单链而另外一半分 子仍处于双链状态时的温度称为该双链DNA的熔解温度， 即Tm。由于G·C碱基对间的氢键数较A·T碱基对间的多，故 G·C含量高的DNA的Tm值也较高。
• PCR反应中引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L，引物浓度偏高会 引起错配和非特异性产物扩增，同时会增加引物之间形二 聚体的几率。
• 传统的DNA纯化方法完全可以满足PCR反应要求。
2. PCR反应的缓冲液
• PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素。
• Mg2＋浓度非常重要，它是PCR反应中DNA聚合酶的 辅助因子。反应体系中许多成分都结合Mg2＋，包 括引物、模板、PCR产物和dNTP。通常，Mg2＋的总 浓度必须超过dNTP的总浓度。在一般的PCR反应中， 1.5~2.0 mmol/L Mg2＋是比较合适的（对应dNTP浓 度为200 μmol/L左右）。
第三章 核酸的分离与分析
第一节 核酸的分离纯化
一、核酸分离提取的原则与要求 二、核酸提取的主要步骤 三、质粒DNA的分离纯化 四、基因组DNA的制备 五、RNA的提取 六、核酸的定量
一、核酸分离提取的原则要求
• 总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 防止降解，排除其它分
子的污染。
如：防止核酸酶，特别是RNase的污染， 又如：提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。
• 琼脂糖凝胶的制备：
不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
将琼脂糖在所需缓冲 液中熔化成清澈、透明 的溶液。然后将熔化液
琼脂糖浓 分离线状DNA分子 度（%） 的范围（kbp）
0.3
5~60
0Байду номын сангаас6
1~20
倒入胶模中，令其固化。 0.7
凝固后，琼脂糖形成一
0.9
1.2
种固体基质，其密度取
1.5
决于琼脂糖的浓度。
• mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解， 分离较为困难。可利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT)亲和色谱 柱分离。
• RNA的提取要点： ①样品细胞或组织的有效破碎； ②核蛋白复合体变性解离，释放出RNA； ③对RNA酶的有效抑制； ④将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离； ⑤多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。 最关键的是抑制RNA酶的活性。