慢病毒简介

重组病毒载体已被用于研究各种发育神经生物学 中的基础问题，以及各种神经退行性疾病的发病机 理和治疗。慢病毒载体能转导分裂的细胞，如神经 元，并介导中枢神经系统（CNS）细胞在体内和体 外基因治疗或报道基因而作为神经生物学研究的有 价值的工具。
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1.1. Lentiviral Gene Delivery to
CNS Cells
Lentivirus preintegration complexes interact with the nuclear pore and undergo active transport into the nucleus of nondividing cells, where the proviral DNA is integrated into the genomic DNA of the host cell. This feature is the primary reason why lentiviruses are being developed as gene-transfer vectors for postmitotic cells in the CNS.
质粒一携带了gag/ pol编码序列及RRE ; 质粒二包含了编码rev的序列; 质粒三是载体质粒; 质粒四表达env。
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3.4自身失活型（SIN）慢病毒载体 SIN载体的构建是在原病毒载体基础上删 除了病毒3’端LTR的U3区增强子和启动子序 列的片段。该区域出现突变则在HIV-1载体 转录后，其5’LTR会因为缺失HIV-1所需要 的启动子和增强子序列而无法复制出完整 长度的病毒基因组。
调节 rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平。
基因 tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。
4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef编码的蛋白则作为毒力
因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序 列(LTR)，内含复制所需的顺式作用元件。
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3.慢病毒载体历史与构建
3.1第一代HIV-1来源的慢病毒载体 以Naldini及Kafri构建的三质粒系统为代表，该系统由包 装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。 包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期 启动子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分 别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达 env。 载体质粒携带了5’端LTR，和全部5’端非翻译区域，另外 还带有rev应答元件（RRE）。 包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G) 用来代替了原病毒的env基因。
自身失活型（SIN）慢病毒载体3’端LTR的U3区 启动子发生失活突变后，在逆转录过程中转移至 5’LTR。这样的载体整合入靶细胞，将不会产生完 整长度的载体RNA，因此命名为“自身失活型载 体”。
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4.重组慢病毒的产生
常用瞬时转染法，即将包膜质粒，包装 质粒和载体质粒共转染人胚肾293T细胞直 接产生生产细胞。最后慢病毒分泌到培养 基中进行培养而得到大量载体慢病毒。
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慢病毒在中枢神经系统中的应用
10Leabharlann Baidu
1. Introduction
Recombinant viral vectors have been used to study a variety of fundamental issues in developmental neurobiology, as well as pathogenesis and treatments for various neurodegenerative diseases. Lentiviral vectors are valuable tools for neurobiology research owing to their ability to transduce nondividing cells, such as neurons, and to introduce therapeutic or reporter genes into central nervous system (CNS) cells in vivo and in vitro.
慢病毒整合前复合物与核孔相互作用进入细胞 核分裂的细胞，其中的前病毒DNA整合到宿主细 胞的基因组DNA并进行主动运输。此功能是为什 么慢病毒在有丝分裂后的细胞在中枢神经系统的 基因转移载体的主要原因。
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Self-inactivating (SIN) vectors reduce the probability of oncogenesis by pro-moter insertion. In SIN vectors, viral promoter activity is deleted from the inte-grated provirus by deletions in the U3 region of the 3’ long terminal repeat (LTR) that are copied during reverse transcription to the 5’LTR.
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3.2第二代HIV-1来源的慢病毒载体
1997年,Zufferey等将包装质粒上的vif、 vpr、vpu和nef基因(即辅助基因)敲除,从而
得到的,其他方面与第一代载体系统一致。
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3.3第三代HIV-1来源的慢病毒载体 为减少复制型病毒的产生，可通过减少辅助质 粒与载体质粒的同源性，或者将gag/ pol和rev编 码序列隔离,分散在不同的质粒上。这样的包装系 统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。
慢病毒简介
2.HIV-1的基因结构
HIV-1为双链RNA病毒，共有9个基因。
编码 病毒
gag基因编码病毒的核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋 白、核衣壳蛋白。
的基 pol基因编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶、
本结 蛋白酶。
构 env基因编码病毒的包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的 靶向性。