金免疫技术(斑点免疫层析试验)

金免疫技术（斑点免疫层析试验）

一、原理

金免疫技术是免疫标记技术之一，金盐被还原成原子金后形成金颗粒悬浮（胶体金），这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。典型的测定方法有斑点买免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。

二、材料

1 、HCG金标试纸条

2、妊娠尿液正常尿液

三、方法

（一）胶体金的制备

根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。

1．枸橼酸三钠还原法

（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。

（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。

（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HA uCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。

（二）胶体金标记蛋白的制备

胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。

1．待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 Na Cl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1 h，去除聚合物。

2．待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0，由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。

3．胶体金与蛋白质（IgG）的结合将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/ L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10

min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常

用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入

的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。4．胶体金标记蛋白的纯化

超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不

同选用不同的离心速度和离心时间。

用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶

粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结

合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB

液（含0.02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。如在

结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。

为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一

步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶

体金与蛋白的结合物。

5．胶体金蛋白结合物的质量鉴定

（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取

金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染

后观察。计算100个金颗粒的平均直径。

（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm

之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1�U20稀释，OD520＝0.25左右。一般应用

液的OD520应为0.2～0.4。

（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色

法（MF－IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝

酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间

接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异

性和敏感性进行鉴定。

6、试验验证

将白色一端插入尿液中，尿液面不超过Max线，5秒钟后取出平放，3mi

n内观察结果。

四、结果

出现一条红线者为妊娠试验阴性，出现两条红线者为妊娠试验阳性，

如无红线出现，表明试纸条失效。