内毒素实验凝胶法资料

凝胶法的试验步骤
❖ 下面我们结合中国药典2010、 GB 14233.2医 用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810 一次性无菌注射器 来看下具体试验方法。
实验步骤
❖ 样品处理方法：
❖ a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水 浸泡器具内腔，在（37±1） ℃恒温箱中孵育不少 于1h，取浸提液进行试验；
❖ 将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放 入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。
鲎试剂灵敏度复核试验
❖ 结果观察
❖
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管
内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或
形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。
❖
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
❖
b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿
内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在
（37±1） ℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进
行试验。
❖
制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求
供试液的PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内，
可用鲎试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的PH
值。
实验步骤
❖ 浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：
❖
塑料器皿置于30％双氧水中浸泡4h，再用细
菌内毒素检查用水充分冲洗后60℃烘干备用。
细菌内毒素的单位
❖ EU称为“内毒素单位” ,是专指内毒素的活性 单位。
❖
IU 称为”国际单位”是经由国际协商规定出
的标准单位。
❖
细菌内毒素检查法概念
❖
本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产Biblioteka Baidu的细菌
内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的
细菌内毒素的耐热性
❖ 细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌 不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才 能使其灭活 。
❖
实验用器具的处理
内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可 能存在的外源性内毒素。
❖
耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180℃
干烤至少2h或者250℃干烤至少30分钟；
❖ 3、 B溶液：用样品浸提液制备1EU/ml浓度的样品阳性对 照液。 4、 C溶液：用检查用水制备1EU/ml浓度的内毒素溶液， 作为阳性对照。
❖ 5、加样反应，取 8 支0.5EU/ml的鲎试剂，各加0.1ml的 细菌内毒素检查用水复溶。然后分别加A、B、C、D溶液 0.1ml， 四种溶液各做两个平行管。 6、放到37度水浴或恒温培养箱中反应60分钟，观察结果。
毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋
涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、1λ、0.5λ和
0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均
应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
鲎试剂灵敏度复核试验
❖ 取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支， 其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶 液，及每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加 入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
鲎试剂灵敏度复核试验
❖ 若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管 均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。 按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎 试剂灵敏度的测定值（λc）
❖ 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最 后一个呈阳性结果的浓度。
❖ 当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方 可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批 鲎试剂的灵敏度。
细菌内毒素检查法 （凝胶法）
苏州大学 卫生与环境技术研究所检测中心
细菌内毒素
❖ 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主 要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下是不释放 出来的，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞上 时，才会表现出毒性。
细菌内毒素的生物活性
❖ 1、致热性。 2、致死性毒性。 3、白细 胞减少。 4、激活凝血系统。 5、降低血压， 休克。 6、 Shwartzman反应。 7、刺激淋 巴细胞有丝分裂，等等 。
❖ 1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶 液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断 合格；否则判断为不合格。
注意事项
❖ 1. 每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的 复核试验；
❖
凝胶法中用到的仪器和器皿
❖ 2. 恒温培养箱
❖
❖ 孵育样品浸提液以及培养试验结果。
凝胶法中用到的仪器和器皿
❖ 3.干烤箱
❖
❖
❖ 用于实验用耐高温器皿的去热源，温度范围要求至少300℃
凝胶法中用到的仪器和器皿
❖ 4. 移液器和无热源的移液尖（或者去热源的刻度吸 管）
❖
5. 试管
凝胶法中用到的试剂
一种方法 。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法，
由于凝胶法操作简单快捷、灵敏度高，并且药典规定当不同
试验方法的结果存在争议时，除另有规定外，以凝胶法为准，
所以凝胶法被广泛应用。
凝胶法概念
❖
凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的
原理来检测或半定量内毒素的方法。
凝胶法中用到的仪器和器皿
1. 超净工作台
❖ 1）鲎试剂 ❖ 2）细菌内毒素工作品 ❖ 3）细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于
0.015EU/ml的无菌注射用水）
鲎试剂灵敏度复核试验
❖ 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何 可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度 复核试验。
鲎试剂灵敏度复核试验
❖
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内
结果观察
B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转 180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体， 不滑落。 而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管， 必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可 信的。最后看A溶液的反应情况：
❖ 阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不 合格；
❖ 阴性就说明小于20EU,结果是合格的；
❖ V－－浸提介质体积，单位为（ml）； ❖ L－－产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的
细菌内毒素的量），单位为EU/件； ❖ λ－－鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。
实验步骤
实验步骤
❖ 检测方法:
1、A溶液：在注射器中抽取细菌内毒素检查用水至总刻度 容量,放置37℃保温不少于1小时。
2、复溶细菌内毒素工作品，得到浓度为10EU/ml的工作 品溶液。