幼苗鉴定图谱
品种纯度检验中存在的问题及建议
2018年第11期扫一扫看全文本文DOI：10.16675/14-1065/f.2018.11.095品种纯度检验中存在的问题及建议□王成顺袁刚摘要：品种纯度检验的方法有很多，真正能广泛应用的方法较少。
田间小区种植鉴定技术简单、适用范围广，是目前应用最广泛的方法，但在实际操作中也存在着一些亟待解决的问题。
关键词：纯度检验；存在问题及建议文章编号：1004-7026（2018）11-0132-02中国图书分类号：S339.31文献标志码：A（秦皇岛市种子管理总站河北秦皇岛066004）品种纯度是构成种子质量的重要指标，是种子质量评价的重要依据，是保证良种优良遗传特性充分发挥的前提。
品种纯度与种子的遗传基础有关，属于品种的遗传品质，品种纯度的高低直接影响作物的产量和品质，全国每年假种子和低纯度种子案件时有发生，给农民和农业生产造成重大损失，真实性和品种纯度鉴定是目前我国种子质量管理中最突出问题之一。
1纯度检验的内容品种纯度检验包括两方面内容，即品种真实性和品种纯度。
品种真实性是指一批种子所属品种、种或属与文件记录是否相符，品种纯度是指品种在特征特性方面典型一致的程度。
在品种纯度鉴定之前，应先进行种子真实性鉴定，如果种子真实性有问题，品种纯度鉴定就毫无意义。
2纯度检验主要方法及评价品种纯度检验的对象可以是种子、幼苗或较成熟的植株，纯度检验的方法很多，但真正能广泛应用的方法较少。
2.1种子形态法种子形态法是最简便、最快速的方法，仅适用于籽粒较大、籽粒形态丰富的作物及品种间差异明显的样品的鉴定，应用价值不大。
2.2幼苗鉴定法适合于幼苗形态性状丰富的作物，如十字花科、豆科等双子叶植物，因苗期所依据的性状有限，测定结果不太准确。
2.3电泳法电泳方法相对来说还是比较快速准确的方法，具有一定的使用价值，但电泳法对于某些品种，特别是亲缘关系较近的品种或组合难以鉴别。
2.4分子技术分子检测技术具有快速准确可靠的特点，特别是SSR法，技术发展迅速，在国内已被广泛应用于各主要作物及蔬菜的品种纯度检验，但SSR法技术复杂、检测成本高，难以在种子检验机构中得到普及和应用。
013幼苗结构与幼苗鉴定幻灯片
• c.菜豆属的初生叶形状正常，大于正常大小的四分之一。 菜豆属的初生叶形状正常， 菜豆属的初生叶形状正常 大于正常大小的四分之一。 • d.具有三片初生叶而不是两片，如菜豆属(采用“50% 具有三片初生叶而不是两片，如菜豆属 采用 采用“ 具有三片初生叶而不是两片 规则”)。 规则” 。 • 2.5 芽鞘： 芽鞘： • a.芽鞘局部损伤。 芽鞘局部损伤。 芽鞘局部损伤 • b.芽鞘从顶端开裂，但其裂缝长度不超过芽鞘的三分 芽鞘从顶端开裂， 芽鞘从顶端开裂 但其裂缝长度不超过芽鞘的三分 之一。 之一。 • c.受内外稃或果皮的阻挡，芽鞘轻度扭曲或形成环状。 受内外稃或果皮的阻挡， 受内外稃或果皮的阻挡 芽鞘轻度扭曲或形成环状。 • d芽鞘内的绿叶，没有延伸到芽鞘顶端，但至少要达 芽鞘内的绿叶 芽鞘内的绿叶，没有延伸到芽鞘顶端， 到芽鞘的一半 露出一半)。 一半(露出一半 到芽鞘的一半 露出一半 。
子叶出土型（菜豆，双子叶）
子叶 下胚轴 初生叶
初生根
下胚轴
上胚轴
子叶出土型（洋葱，单子叶）
2、子叶留土型 、
子叶或变态子叶（盾片） 子叶或变态子叶（盾片）留在土壤中的种 例如单子叶植物的稻麦类、 皮内一种发芽习性 ，例如单子叶植物的稻麦类、 禾本科） 玉米 （禾本科）等；豆科的蚕豆和豌豆属于此 种类型。 种类型。 发芽期间它们下胚轴几乎没有伸长， 发芽期间它们下胚轴几乎没有伸长，仅子 叶以上的上胚轴或禾本科的胚芽鞘和中胚轴伸 上胚轴或禾本科的 叶以上的上胚轴或禾本科的胚芽鞘和中胚轴伸 它们连同胚芽向上伸出地面， 长，它们连同胚芽向上伸出地面，形成植株的 茎叶系统，子叶或盾片留在土壤中的种皮内， 茎叶系统，子叶或盾片留在土壤中的种皮内， 直至内部养料耗尽而逐渐解体。 直至内部养料耗尽而逐渐解体。
杂交水稻品种鉴定方法（综述）
品种鉴定是种子市场监管和品种审定准入的主要内容，是育种工作的重要阶段，也是衡量成果能否转化的重要环节。
因此，品种鉴定在种子生产、加工、储藏及经营贸易等流通过程中具有重要意义和应用价值。
但在种子流通中，为节省成本与缩短时间周期，往往忽略品种鉴定的重要性，导致仍有种子掺假的案件发生，给生产造成了难以挽回的损失[1]。
杂交水稻是我国最主要的农作物，对保障国家粮食安全起到举足轻重的作用，因此，随着全国杂交水稻种植面积比重逐年增大，对杂交水稻种子的质量（主要是真实性和纯度）检查和监督尤为重要。
目前，杂交水稻品种鉴定的方法主要有形态鉴定法、生化鉴定法、DNA 分子技术鉴定法。
1形态鉴定法1.1种子形态鉴定法种子形状比较稳定，故形态鉴定方法简单，快速经济。
主要通过观察种子的外观形态特征，包括种子的长宽度与大小、形状、颜色、光泽、种皮形态、垩白、胚乳等性状，借助仪器或工具（如放大镜、解剖镜等）观察，进行品种鉴定，一般情况下可鉴定出杂交水稻样品的真实性[2-3]。
但由于这些性状只适用于品种间差异较大的样品鉴定，且受鉴定者经验的制约，品种鉴定结果可靠性较差，应用范围较窄。
1.2幼苗形态鉴定法在相同条件的温湿度、光照等环境下，对种子进行培养，当发芽良好的种子生长发育到适合鉴定的幼苗阶段，结合独特的形态特征进行比较鉴定。
李稳香等用幼苗形态鉴定法，发现应用于鉴定威优、汕优、协优系统的杂交一代均有较好效果，尤以鉴定威优46效果与田间种植鉴定结果均基本一致[4]。
此鉴定方法较简单，易于操作，成本低，鉴定周期短，鉴定结果较准确。
但由于幼苗期所依据的性状有限，且受种子处理方法与生长环境的影响颇大。
因此，该鉴定方法只适用于幼苗形状差异较明显的品种。
1.3田间种植鉴定法田间种植是鉴定品种最为可靠的方法之一，主要依据品种的特征特性进行鉴定。
将种子适时催芽、播种，秧苗栽插到田间，通过水肥管理、病虫害预防等，直到抽穗时进行鉴定。
我国每年冬季都会在海南岛进行田间种植鉴定，这种鉴定方法比较简单，鉴定结果较为符合大批量的实际生产。
种子发芽试验—幼苗鉴定细则
二、甜瓜、西瓜属不正常幼苗鉴定图谱
（四）下胚轴畸形，缩短变粗 ①②③下胚轴畸形 ④正常幼苗（对照）
二、甜瓜、西瓜属不正常幼苗鉴定图谱
（五）子叶腐烂 ①②③子叶腐烂变色 ④正常幼苗（对照）
种子生产与经营专业
豌豆属不正常幼苗鉴定图解
一、豌豆种子构造和发芽及幼苗发育特性
（一）豌豆种子构造
豌豆种子属于双子叶植物，外面有种皮， 里面是胚， 包括： 胚根， 胚 芽 ，胚轴， 子叶(两片)。
二、豌豆属不正常幼苗鉴定图谱
（四）上胚轴生长障碍，分叉 ①上胚轴生长受阻 ②上胚轴分叉 ③正常幼苗（对照）
二、豌豆属不正常幼苗鉴定图谱
（五）幼苗黄化不能形成 正常叶绿素
①②幼苗畸形黄化 ③正常幼苗（对照）
一、豌豆种子构造和发芽及幼苗发育特性 （二）发芽和幼苗发育特性
பைடு நூலகம்
二、豌豆属不正常幼苗鉴定图谱
（一）子叶枯萎变色 ①②③子叶枯萎变色 ④正常幼苗（对照）
二、豌豆属不正常幼苗鉴定图谱
（二）顶芽畸形 ①②顶芽畸形 ③正常幼苗（对照）
二、豌豆属不正常幼苗鉴定图谱
（三）顶芽缺失 ①②顶芽缺失 ③正常幼苗（对照）
种子生产与经营专业
甜瓜、西瓜属不正常幼苗鉴定图解
一、甜瓜、西瓜种子构造和发芽及幼苗发育特性 （一）甜瓜种子构造
一、甜瓜、西瓜种子构造和发芽及幼苗发育特性 （二）甜瓜发芽和幼苗发育特性
一、甜瓜、西瓜种子构造和发芽及幼苗发育特性 （三）西瓜种子构造
一、甜瓜、西瓜种子构造和发芽及幼苗发育特性 （四）西瓜发芽和幼苗发育特性
二、甜瓜、西瓜属不正常幼苗鉴定图谱
（一）初生根矮化和生长障碍， 而次生根发育良好为正常幼苗
①②③为正常幼苗
道地药材霍山石斛及其相似种的分子鉴定
收稿日期:2008-04-27;修回日期:2009-03-31作者简介:刘明珍(1974-),女,汉,助理研究员,硕士,主要从事药用植物的组培及分子生物学研究;通讯作者:陈乃富(1962-),男,汉,教授,硕士,主要从事植物生化及植物资源开发应用研究,E 2mail:cnf505@s ohu 1com 。
基金项目:皖西学院自然科学青年研究项目(WXZ Q0716);植物细胞工程安徽省工程技术研究中心重点资助项目(CPCG2007001A )doi ∶10.3969/j 1issn 11008-9632.20091051034道地药材霍山石斛及其相似种的分子鉴定刘明珍1,陈乃富2,3,刘秀珍4,邓 辉2,3,李耀亭2,3,何祥林5(11皖西学院专科部,六安237012;21植物细胞工程安徽省工程技术研究中心,六安237012;31皖西学院化学与生命科学系,六安237012;41巢湖学院体育系,巢湖238000;51安徽省霍山县长冲中药材有限责任公司,霍山237266)摘要:为检测霍山石斛与霍山产铜皮石斛、霍山产铁皮石斛及其它产地的几种药用石斛的差异,对霍山石斛及其相似种进行I SS R 分子标记比较研究。
结果表明,尽管霍山石斛及其相似种的外部形态差异较小,但在I SSR 分子标记指纹图谱上却存在着显著而稳定的差异。
因此,根据I SS R 分子标记指纹图谱所显示的多态性位点差异,能准确鉴别霍山石斛及其相似种植物及药材。
此方法简单、稳定性高、可重复性好,在霍山石斛的分子鉴定研究中有较大的应用价值。
关键词:霍山石斛;霍山产铜皮石斛;霍山产铁皮石斛;I SSR 分子标记指纹图谱;鉴别中图分类号:Q94312文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2009)05-0034-03霍山石斛(D endrobium huoshanense C 1Z 1Tang et S 1J 1Cheng ),又名霍石斛、霍斛、米斛、大别山石斛。
玉米种子纯度鉴定方法
玉米种子纯度鉴定方法作者：刘景云来源：《现代农业科技》2011年第03期摘要总结了几种玉米种子纯度的鉴定方法，包括籽粒形态鉴定法、幼苗鉴定法、田间小区种植鉴定法、生化指纹图谱鉴定法、DNA指纹图谱鉴定法等内容，以期为玉米种子的标准化鉴定提供参考。
关键词玉米种子；纯度；鉴定方法中图分类号 S513；S339.31 文献标识码B文章编号 1007-5739（2011）03-0103-02玉米种子纯度鉴定包括品种真实性和品种纯度鉴定，品种真实性是指一批种子所属品种、种或属与品种描述（标签和品种描述等）是否相符。
品种纯度是指品种个体和个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数（或株、穗数）占供检本作物种子数（株、穗数）的百分率表示[1]。
玉米种子纯度是玉米种子分级的主要依据，是决定玉米产量高低的重要因素之一，而且是种子包装必须标注的指标之一。
企业生产和销售的每一批种子都必须经过严格的纯度检验，为了方便、快速、准确地鉴定种子纯度，对其方法的研究显得尤为重要。
1籽粒形态鉴定法籽粒形态鉴定法主要是利用种子的花粉直感现象，来判断种子是否杂交，从而鉴定种子纯度的方法。
种子个体性状的遗传信息是由DNA成对的显性基因和隐性基因决定的，当代种子表现其显性性状，F0代种子的胚乳是由母本子房接受父本花粉发育而来，并表现出花粉显性的直感现象，从而表现父本种子的显性特征。
例如，以黄早四类型为母本，以籽粒深色型为父本的玉米种子可以利用籽粒形态鉴定法，由于母本籽粒浅黄透明、白顶等性状是由隐性基因所控制，而其父本深黄色、不透明、黄顶等性状是由显性基因所控制，其F0代种子由于花粉直感现象，籽粒变为黄色或深黄色、透明度差、无白顶现象。
利用此种籽粒变化来鉴定品种真实性和品种纯度。
籽粒形态鉴定法虽然省时、省工，靠种子检验工作者的经验，但具有很大的局限性，只有特定组合才可以利用此方法。
特别是在种子调运过程需做出快速判断时才可以应用。
辣椒主要病虫害图谱ppt课件
成虫和若虫锉吸辣椒的花器、果实 和嫩叶，被害部位呈银白色斑点， 影响品质和产量。
夜蛾类害虫
斜纹夜蛾
初孵幼虫群集叶背取食叶肉，留下表 皮和叶脉，被害叶呈纱网状。
甜菜夜蛾
低龄幼虫吐丝拉网，群集叶背取食叶肉， 留下表皮和叶脉，3龄后分散为害，可 将叶片吃成孔洞或缺刻，严重时仅余叶 脉和叶柄。
螨虫类害虫
产量。
品质影响
受病虫害侵害的辣椒果实往往变形、 变色、味道苦涩，商品性大大降低， 甚至可能对人体健康造成危害。
经济损失
辣椒病虫害的发生不仅会导致产量 和品质下降，还会增加防治成主要病害及图谱
疫病
症状
疫病是辣椒上的一种毁灭性病害，苗期和成株期均可发病，以成株期发病最重。病斑水渍状， 暗绿色，后迅速扩大，边缘不明显，病斑环绕茎部，导致上部叶片枯萎死亡。
病原
病原为辣椒疫霉菌，属鞭毛菌亚门真菌。
防治方法
选用抗病品种、实行轮作、加强田间管理、药剂防治等。
病毒病
症状
病毒病是辣椒上的一种重要病害，主 要表现为花叶、黄化、坏死和畸形等 症状。病株生长缓慢，果实变小，产 量降低，品质变劣。
病原
防治方法
选用抗病品种、防治蚜虫等传毒媒介、 加强田间管理等。
病原为多种病毒，如黄瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒等。
病原菌的积累。
04
清洁田园
收获后及时清除病
03
株、残叶和杂草，
减少病源。
加强田间管理
合理密植，科学施 肥，及时排水，保 持田间通风透光。
生物防治措施
利用天敌昆虫
保护和利用天敌昆虫，如瓢虫、草蛉等，减少害 虫数量。
微生物制剂防治
使用生物农药和微生物制剂，如Bt乳剂、白僵菌 等，防治病虫害。
牛小兵 论文.doc 2
党参种子发芽检验标准研究中草药栽培与鉴定2010级牛小兵指导老师张延红摘要：[目的]本文针对目前党参中药材种子无统一发芽测定方法及国家标准，种子质量控制无法可依的现状，确定党参种子适宜的发芽条件。
[方法]借鉴国际种子质量检验规程，应用发芽势、发芽率和发芽指数等指标，对影响党参种子发芽试验的前处理、光照条件、温度和发芽床进行了研究。
[结果]试验确立了党参种子发芽的适宜条件：2%NaClO处理10min，20℃恒温黑暗培养适合党参种子的萌发，发芽床以沙上最佳。
根据种子萌发特性，确定了发芽势和发芽率的统计时间，5d为初次计数时间，9d为末次计数时间。
[结论]前处理、光照条件、温度和发芽床对党参种子发芽均有显著的影响，其最适发芽条件可作为党参种子的质量检验参考标准。
关键词：党参种子；发芽试验；发芽温度；发芽床党参：为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.、素花党参Codonopsis pilosula Nannf.var. modesta （Nannf.） L. T. Shen或川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根。
别名：防风党参、黄参、防党参、上党参、狮头参、中灵草、黄党。
是我国常用名贵药材之一，在中医药中使用量很大，性平，味甘、微酸。
归脾、肺经。
具有补中益气，健脾益肺。
用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消渴。
主要分布于山西中部、陕西南部、甘肃、青海、四川西北部等。
对党参形态学、生物学、化学成分、药理作用、组织培养等方面的研究较多，但对党参种子发芽检验标准较少，无法对市场上的种子的质量进行有效控制，致使种子市场混乱。
发芽试验是检验种子质量的重要依据，发芽试验的标准化可有效促进种子市场的规范化。
本研究较全面地探讨了影响种子发芽的前处理、光照条件、温度、发芽床等因素，寻找适于党参种子萌发的最佳条件及幼苗鉴定标准，并确定种子发芽试验的初次和末次记数时间，为制定种子质量检验规程提供依据。
种子室内检验技术—品种真实性和纯度的室内测定概述
品种真实性和纯度鉴定的方法分类
品种真实性和纯度鉴定的方法分类
为鉴定品种真实性和品种纯度，必须找出品种之间形态学、 生理学、物理学、化学、生物化学、分子生物学等方面的差异。
在实际应用中可根据检验目的和要求的不同，本着简单易行、 成本低廉、省时快速、结果准确、重演性好的原则，选择合适 的方法。
四、品种纯度检验方法的要求
在实际应用过程中，理想的测定方法要达到4个要求： （1）测定结果在不同实验室或同一实验室能重演； （2）方法应简单易行； （3）省时快速； （4）成本低廉。
三、物理化学法鉴定
1、物理鉴定 （荧光分析法测定种子或幼苗的方法） 不同作物或不同品种，其种皮结构和化学组成不同，因此在紫外 光照射下发出的荧光颜色也不同。 如十字花科不同种发出荧光不同：白菜为绿色，萝卜为浅蓝绿色， 白芥为鲜红色，黑芥为深蓝色，田芥为浅蓝色。
三、物理化学法鉴定
2、化学鉴定 鉴定品种的化学特性主要是根据不同品种的种子化学成分的差异， 用化学药剂处理后所产生的颜色的差异区分不同品种。 常用的化学测定法有：麦类和水稻的苯酚染色法、大豆种子的愈 创木酚染色法等。
一、品种真实性和品种纯度的含义
3、异型株 异型株是指一个或多个性状（特征、特性）与原品种的性状明显 不同的植株。在纯度检验时主要鉴别与本品种不同的异型株。
异型株
一、品种真实性和品种纯度的含义
4、育种家种子 育种家种子是育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最 初一批种子，用于进一步繁殖原种的种子。 5、原种 原种是用育种家种子繁殖的第一代至第三代，或按原种生产技术 规程生产的达到原种质量标准的种子，用于进一步繁殖大田用种。 6、大田用种 用常规种原种繁殖的第一代至第三代或杂交种，经确定达到规定 质量要求的种子。
DNA指纹图谱在农作物品种鉴定中的应用
DNA(脱氧核糖核酸)是细胞染色体中的遗传基因,其分子各个片段就代表各个遗传信息。
由于DNA指纹图谱直接反映DNA水平上的差异,它成为当今最先进的遗传标记系统。
DNA指纹图谱技术主要有:限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polym or2 phism,简称RF LP)、随机扩增多态性(Random am plified polym orphic DNA,简称RAPD)、小卫星DNA (Mini2satellite DNA)、微卫星DNA (Microsatellite DNA)、内部简单重复序列(ISSR)、扩增片段长度多态性(Am plified fragment length polym or2 phism,简称AF LP)等等。
一、DNA指纹图谱的方法11RF LP方法RF LP方法是G rodzicker等人于1974年发明的。
它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。
RF LP方法于上个世纪80年代开始应用于植物,在水稻、小麦、玉米、蕃茄和马铃薯等作物上的研究都已有报道。
但RF LP的多态信息含量是相对而言的,在一些作物上RF LP探针可进行品种间及种间的鉴别,而在小麦、马铃薯、大豆等作物上的多态性较低。
特别是小麦,它是严格的自花授粉作物,基因组较大,多态性很低(即使在相当分散的品种间也是如此)。
因而,RF LP方法在指纹图谱中的应用受到限制。
21RAPD方法RAPD方法是Willams等人于1990年发明的。
它是利用扩增DNA片段长度差异来检测生物个体的分子标记技术。
它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行基因组指纹图谱的构建。
其相对于RF LP方法较简便,DNA用量也较少,且省去了使用放射性同位素,受到了许多学者的重视。
Welth1991年曾用RAPD分析玉米杂交种的品种纯度,He等人1992年曾用RAPD识别小麦品种,在花生、小麦、水稻等作物上也曾进行过深入研究。
幼苗鉴定图谱
不正常幼苗类型初生根发育不全、粗短、停滞、残缺、断裂。
初生根从顶端开裂、缩缢、细长、卷缩在种皮内、负向地性。
初生根玻璃状、有初次感染所引起的腐烂、仅有一条或缺失种子根。
胚轴缩短而变粗、不能形成块茎<仙客来属>、深度的裂缝或破裂、中部又宽的裂缝、缺失胚轴缩缺失、缩缢、严重扭曲、过度弯曲、形成环状或螺旋形胚轴缩细长、玻璃状、初次感染引起的腐烂子叶肿胀或卷曲、畸形、断裂、缺失、变色子叶坏死、玻璃状、初次感染所引起的腐烂子叶缩短而扭曲、收缩变小、弯曲、形成环状或略旋形、无明显的‘膝’、细长初生叶畸形、损伤、残缺初生叶变色<坏死>、有初次感染而引起的腐烂、形态正常、但小于正常的1/4。
顶芽畸形、损伤、残缺、有初次感染而引起的腐烂。
芽鞘和第一片叶畸形、损伤、残缺、严重弯曲。
芽鞘形成环状或螺旋形、严重扭曲、裂缝长度从顶端量超过1/3，茎部开裂。
茎部细长、有初生感染所引起的腐烂、延伸长度不积芽鞘的一半、残缺、撕裂或其它的畸形。
瓜属图片（瓜属）初生根矮化、生长受阻、有足够的次生根、属于正常幼苗。
（瓜属）初生根生长受阻、无足够的次生根。
（瓜属）初生根生长受阻、有足够的次生根。
瓜属图片（瓜属）下胚轴短而厚。
瓜属图片（瓜属）子叶腐烂。
棉属图片（棉属）初生根矮化。
（棉属）初生根受抑制。
（棉属）初生根加在种皮内。
（棉属）初生根霉烂。
棉属图片（棉属）子叶部分枯斑。
菜豆属图片（菜豆属）下胚轴短。
（菜豆属）下胚轴从右侧纵向裂开。
（菜豆属）下胚轴缺失。
（菜豆属）下胚轴弯曲。
菜豆属图片（菜豆属）子叶断裂无色。
（菜豆属）子叶枯斑。
菜豆属图片（菜豆属）初生叶畸形缺失。
（菜豆属）初生叶缺失。
菜豆属图片（菜豆属）顶芽受损。
（菜豆属）顶芽畸形。
（菜豆属）顶芽缺失。
（菜豆属）顶芽缺失。
菜豆属图片（菜豆属）幼苗黄色。
（菜豆属）幼苗黄色。
小麦属图片（小麦属）种子根短而粗、胚芽鞘畸形。
（小麦属）只有一条种子根或无种子根。
小麦属图片（小麦属）胚芽鞘畸形。
利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):１~８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.００１收稿日期:２０２３－０４－２１基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１２００５００)ꎻ国家大宗蔬菜产业技术体系项目(ＣＡＲＳ－２３－Ａ０６)ꎻ国家自然科学基金项目(３１８７２９４９)作者简介:章力(１９９５ )ꎬ女ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:９８７７２５９９９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:黄泽军(１９７４ )ꎬ男ꎬ湖南郴州人ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｚｅｊｕｎ＠ｃａａｓ.ｃｎ利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代章力１ꎬ２ꎬ魏凯１ꎬ２ꎬ李珊珊１ꎬ宁宇１ꎬ路菲菲１ꎬ王孝宣１ꎬ国艳梅１ꎬ刘磊１ꎬ李鑫１ꎬ杜永臣１ꎬ李君明１ꎬ黄泽军１(１.中国农业科学院蔬菜花卉研究所/蔬菜生物育种全国重点实验室ꎬ北京㊀１０００８１ꎻ２.中国农业大学园艺学院ꎬ北京㊀１０００８１)㊀㊀摘要:转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良ꎬ其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节ꎮ本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ搜索结果ꎬ克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ꎮ利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ的编码区序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因的终止密码子前ꎬ形成一个嵌合基因ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ将嵌合基因插入到ｐＢＩ１２１双元载体ꎬ构建植物表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎬ利用农杆菌介导法转化番茄品种 ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ ꎬＴ０代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光ꎮＰＣＲ分子标记进一步验证发现ꎬ红色荧光种子萌发的幼苗均存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎬ表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为１００％ꎮ由此ꎬ本研究建立了一种利用ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎬ可以通过种子红色荧光可视化分析ꎬ简单快速㊁低成本地鉴定转基因番茄后代的方法ꎮ关键词:番茄ꎻ种子ꎻ红色荧光蛋白ꎻ油体蛋白ꎻ转基因鉴定中图分类号:Ｓ６４１.２:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－０００１－０８ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｏｍａｔｏＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＯｆｆｓｐｒｉｎｇｗｉｔｈＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭａｒｋｅｒｏｆＳｅｅｄｓＺｈａｎｇＬｉ１ꎬ２ꎬＷｅｉＫａｉ１ꎬ２ꎬＬｉＳｈａｎｓｈａｎ１ꎬＮｉｎｇＹｕ１ꎬＬｕＦｅｉｆｅｉ１ꎬＷａｎｇＸｉａｏｘｕａｎ１ꎬＧｕｏＹａｎｍｅｉ１ꎬＬｉｕＬｅｉ１ꎬＬｉＸｉｎ１ꎬＤｕＹｏｎｇｃｈｅｎ１ꎬＬｉＪｕｎｍｉｎｇ１ꎬＨｕａｎｇＺｅｊｕｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓａｎｄＦｌｏｗｅｒｓꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｉｏｂｒｅｅｄｉｎｇꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｏｍａｔｏ.Ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｏｆｆｓｐｒｉｎｇｉｓａｃｏｓｔ/ｌａｂｏｒ￣ｉｎｔｅｎｓｉｖｅａｎｄｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ.Ｗｅｃｌｏｎｅｄａｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｏｍａｔｏｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄａｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅｔｏｍａｔｏｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｂａｓｅＳＧＮ￣ＴＥＡ.ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅＴａｇＲＦＰｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎｏｆＳｌＯＬＥ１ｇｅｎｅｔｏｐｒｏｄｕｃｅａｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰꎬｗｈｉｃｈｗａｓｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏ￣ｍａｔｏｖａｒｉｅｔｙＭｏｎｅｙＭａｋｅｒｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｓｅｅｄｓｆｒｏｍｓｅｌｆ￣ｃｒｏｓｓｅｄＴ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｂｒｉｇｈｔｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｒｎｏｔｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ.ＦｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＰＣＲｍｏｌｅｃｕ￣ｌａｒｍａｒｋｅｒｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｇＲＦＰｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｒｉｓｉｎｇｆｒｏｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｅｄｓꎬｉｎｄｉｃａ￣ｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｐｒｏｇｅｎｙｂｙｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｔｓｅｅｄｓｔａｇｅｗａｓ１００％.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｔｈｉｓｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｉｍｐｌｅꎬｆａｓｔａｎｄｌｏｗ￣ｃｏｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｏｆｆｓｐｒｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｓｅｅｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＴｏｍａｔｏꎻＳｅｅｄꎻＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＯｌｅｏｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎꎻＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ㊀㊀转基因技术以及借助转基因的基因编辑技术ꎬ促进了植物基因功能研究ꎬ而且有助于改良植物性状和培育优良新品种ꎮ植物遗传转化后ꎬ转化植株及其后代中外源ＤＮＡ的检测是一个十分必要的环节ꎬ但工作量大㊁效率有待提高ꎮ在植物的遗传转化工作中ꎬ常借助选择基因和报告基因筛选转基因植株ꎮ以卡那霉素(ｎｐｔＩＩ)和潮霉素(ｈｐｔ)等抗生素或者ＥＰＳＰＳ和Ｂａｒ等除草剂抗性基因作为选择基因进行筛选[１－２]ꎬ不同植物材料对筛选剂所需的最适浓度差别较大ꎬ会出现假阳性结果ꎬ甚至有时会影响植株的正常生长ꎮ利用ＧＵＳ作为报告基因筛选时ꎬ需要对转基因植株组织进行ＧＵＳ染色检测[３]ꎬ会破坏植物组织ꎮＦＡＳＴ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｓｅｅｄｔｅｃｈｎｏｌ￣ｏｇｙ)是一种通过种子特异性启动子驱动荧光融合蛋白表达ꎬ利用种子荧光快速筛选转基因植株的方法ꎬ最早应用于模式植物拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)[４]ꎮ荧光蛋白是一类在特定波长下激发强烈荧光的蛋白质ꎬ可作为报告基因用于检测基因特异性表达和融合蛋白分子的定位㊁迁移㊁构象变化以及分子间的相互作用[５－９]ꎮ红色荧光蛋白(ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＲＦＰ)是从海葵(Ｄｉｓｃｏｓｏ￣ｍａｓｐｓｐ.)中分离出的与绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)同源的荧光蛋白[１０]ꎬ激发波长和发射波长均较长ꎬ其中ꎬＴａｇＲＦＰ的激发波长和发射波长分别为５５５ｎｍ和５８４ｎｍꎬ其亮度大约是ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白的３倍ꎬ具有高ｐＨ稳定性和荧光寿命长等特点ꎬ是目前所报道的相对较亮的单体红色荧光蛋白[１１]ꎮＦＡＳＴ技术将荧光蛋白作为可视化筛选标记直接鉴定转基因种子ꎬ方法简便且不会对植株产生破坏ꎬ能够降低大面积种植的成本ꎬ有效提高筛选效率[４]ꎮ油体蛋白(ｏｌｅｏｓｉｎ)是一类特殊的贮藏蛋白ꎬ有些油体蛋白在植物种子中特异表达ꎮ当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的Ｎ端或Ｃ端后不会影响其表达和定位ꎬ且融合蛋白非常稳定[１２－１３]ꎮ番茄(Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ)是一种具有重要经济价值的蔬菜作物ꎬ也是果实发育基础研究的模式植物ꎮ转基因技术和基因编辑技术已经大量应用于番茄基础研究和性状改良ꎬ然而传统的方法无法在种子阶段区分转基因和非转基因材料ꎬ转基因后代鉴定效率比较低ꎮ本研究参考ＦＡＳＴ技术ꎬ利用番茄种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１启动子驱动ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ利用种子红色荧光快速有效筛选番茄转基因后代ꎬ为后续的基因功能研究和性状改良带来便利ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与菌株番茄品种 ＲｉｏＧｒａｎｄｅ 来自美国俄亥俄州立大学ＥｓｔｈｅｒｖａｎｄｅｒＫｎａａｐ实验室ꎬ于２０２０年种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区温室ꎮ番茄品种 ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ (ＭＭ)的种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄遗传育种课题组扩繁保存ꎮ大肠杆菌ＤＨ５α和农杆菌ＧＶ３１０１购自上海唯地生物技术有限公司ꎮ１.２㊀番茄油体蛋白的鉴定与分析根据拟南芥油体蛋白研究结果[１４－１６]ꎬ从ＴＡＩＲ(ｔｈｅａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅ)数据库下载１７个拟南芥油体蛋白序列ꎮ以拟南芥油体蛋白序列为查询序列ꎬ采用ＢＬＡＳＴＰ(ｅ－ｖａｌｕｅ<１Ｅ－５)在茄科基因组数据库ＳＧＮ(ｓｏｌａｎａｃｅａｅｇｅ￣ｎｏｍｉｃｓｎｅｔｗｏｒｋ)中检索番茄油体蛋白ꎮ从ＮＣＢＩ数据库获得水稻(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ)油体蛋白序列ꎮ利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件进行番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白多序列比对ꎬ使用ＭＥＡＧ－Ｘ软件㊁采用最大似然法(ｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)构建油体蛋白序列的进化树ꎮ利用番茄果实发育成熟高分辨率时空转录图谱数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ｅｄｕ/)分析油体蛋白基因在成熟期果实组织的表达模式ꎮ１.３㊀ＴａｇＲＦＰ和番茄油体蛋白基因的克隆以中国农业科学院蔬菜花卉研究所张金喆老师惠赠的含红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ编码序列的番茄ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物ＺＰ３１１ꎬ利用高保真聚合酶预混液ＡｐｅｘＨＦＦＬＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ(艾科瑞生物)ꎬ对ＴａｇＲＦＰ进行ＰＣＲ扩增ꎮ反应程序为:９４ħ１ｍｉｎꎻ９８ħ１０ｓꎬ６０ħ１５ｓꎬ６８ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎮ以ＣＴＡＢ法[１７]提取的番茄品种ＲｉｏＧｒａｎｄｅ幼嫩叶片的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏｌｅ００２扩增番茄油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)全长序列ꎮ引物序列见表１ꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ采用ＥａｓｙＰｕｒｅ®ＱｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ(全式金)进行胶回收纯化ꎮＴａｇＲＦＰ和ＳｌＯＬＥ１的回收产物均与ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体(全式金)连接ꎬ转化至ＤＨ５α感受态细胞ꎬ挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ表１㊀基因克隆引物引物名称正向引物序列(５'－３')反向引物序列(５'－３')ＺＰ３１１ＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＯｌｅ００２ＧＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＴＡ１.４㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的构建根据ＳｌＯＬＥ１克隆载体序列和ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎬ采用软件ＣＥＤｅｓｉｇｎ设计无缝克隆引物(表２)ꎮ无缝克隆采用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(诺唯赞)ꎬ反应条件为３７ħ连接３０ｍｉｎꎮ以Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｌｉｎｅ００５进行反向ＰＣＲꎻ以ＴａｇＲＦＰ克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ００５扩增ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎮ分别对ＰＣＲ产物进行胶回收纯化ꎬ然后进行无缝克隆ꎬ将ＴａｇＲＦＰ编码序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面ꎬ构建ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎬ嵌合基因序列中仅保留１个终止密码子ꎮ使用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶对ｐＢＩ１２１植物双元表达载体(华越洋)进行双酶切ꎬ以克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０扩增ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因片段ꎬ胶回收纯化后与ｐＢＩ１２１双酶切产物进行无缝克隆ꎬ构建表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ表２㊀无缝克隆引物引物名称正向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)反向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)Ｌｉｎｅ００５ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴ￣ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴ￣ＧＡＴＧＴＧＩｎｓｅｒｔ００５ｔｃａｃｔｇｇａａｃｃｃａｔｃａｇａｃｔＡＴＧＡＧ－ＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡａａｇｔａｇａｇａｇｔａｇｃｇｃｔａｇｃＴＣＡＣＴＴ￣ＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＩｎｓｅｒｔ０１０ｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔＧＡＣＧＡＡＴＧ￣ＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａｔｔｃＣＧ￣ＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣ￣ＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧ１.５㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的遗传转化利用冻融法将表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ通过农杆菌介导法进行番茄ＭＭ子叶的遗传转化ꎮ遗传转化方案参照文献[１８]ꎬ将ＭＭ的种子消毒后置于１/２ＭＳ培养基ꎬ待子叶展开且真叶尚未长出时剪下子叶ꎬ在Ａ１培养基中暗培养２ｄ后进行侵染ꎬ侵染的子叶继续在Ａ１培养基中培养２ｄꎬ经Ａ２培养基诱导得到愈伤组织和分化的芽ꎬＡ３培养基分化培养得到小苗ꎬ最后由Ａ４培养基生根培养得到生根小苗后移栽至中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场玻璃温室ꎮ１.６㊀转基因番茄的ＰＣＲ检测和种子荧光鉴定提取转基因番茄植株的ＤＮＡꎬ根据表达载体中ＴａｇＲＦＰ两侧序列设计引物Ｏ＋Ｒ－７(Ｆ:ＧＧＴＡ￣ＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＧＧＡꎻＲ:ＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＴＣＧ￣ＴＡＧＣ)ꎬＰＣＲ检测Ｔ０代植株中是否插入ＴａｇＲＦＰ基因序列ꎮ将Ｔ０代阳性转基因植株自交授粉收获的干燥种子ꎬ置于徕卡体视荧光显微镜(ＬｅｉｃａＭＺ１０Ｆ)下进行荧光成像和拍照ꎮ挑选呈现荧光和无荧光的种子分别催芽ꎬ真叶长出后提取ＤＮＡꎬ进一步通过ＰＣＲ验证番茄转基因后代中是否含有ＴａｇＲＦＰ基因ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀番茄油体蛋白基因分析在ＳＧＮ数据库中检索到番茄中有９个油体蛋白编码基因ꎬ分别是Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０８６４９０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１９８２０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６０８４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６９２６０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０６６０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０７８１６０和Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０ꎮ在ＮＣＢＩ数３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代据库中检索到６个水稻油体蛋白编码基因:Ｏｓ０１ｇ０６４３９００㊁Ｏｓ０３ｇ４９１９０㊁Ｏｓ０４ｇ０５４６５００㊁Ｏｓ０５ｇ０５７６７００㊁Ｏｓ０６ｇ０４７３８００和Ｏｓ０９ｇ０３２４０００ꎮ为了明确番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白之间的亲缘关系ꎬ对番茄９个㊁拟南芥１７个和水稻６个的油体蛋白构建分子进化树(图１Ａ)ꎮ在进化树中ꎬ番茄油体蛋白基因Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０与拟南芥中的ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和ＡＴ５Ｇ５１２１０基因以及水稻的Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)和Ｏｓ０４ｇ０５４６５００(ＯｓＯＬＥ３)基因亲缘关系最近ꎮＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)是拟南芥种子中最丰富的油体蛋白[１９]ꎮ利用自身启动子分别驱动ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)㊁Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)基因与ＧＦＰ基因的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因拟南芥和水稻的种子呈现出绿色荧光[２０]ꎮ随后检索番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)ꎬ发现Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０和Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因在红熟期种子中的表达量居前三ꎬＲＰＭ值分别为２１１４.９４㊁１７１９.４１和１１８５.１５ꎮ由于Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０在番茄红熟期果实的其他组织中几乎不表达(图１Ｂ)ꎬ且其编码蛋白与拟南芥ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和水稻Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)蛋白序列相似性最高ꎬ因此ꎬ推测Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因(以下简称ＳｌＯＬＥ１)启动子可以驱动融合蛋白在番茄种子中表达ꎮ图１㊀番茄㊁拟南芥和水稻的油体蛋白进化树(Ａ)及番茄ＳｌＯＬＥ１基因在红熟期果实和㊀㊀总果皮的表达模式(Ｂ)(基因表达数据来自ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)２.２㊀种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ构建以番茄 ＲｉｏＧｒａｎｄｅ 的ＤＮＡ为模板ꎬ经引物Ｏｌｅ００２扩增得到长度为４００４ｂｐ的ＳｌＯＬＥ１基因全长片段(图２Ａ)ꎬ其中含启动子和终止子序列长度各约１.７ｋｂꎮ利用引物ＺＰ３１１扩增ＴａｇＲＦＰ编码区序列(７１５ｂｐꎬ图２Ｂ)ꎮＰＣＲ扩增片段分别连入ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体ꎬ测序后获得序列正确的克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１和Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰꎮ将质粒Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１通过反向ＰＣＲ线性化(引物Ｌｉｎｅ００５ꎬ表２)ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物(引物Ｉｎ￣ｓｅｒｔ００５ꎬ表２)进行无缝克隆ꎬ成功在ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面插入ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ获得重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎮ将ｐＢＩ１２１双元载体的ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双４山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀酶切产物ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物无缝克隆(引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０ꎬ表２)ꎮ无缝克隆产物转化大肠杆菌ＤＨ５αꎬ利用引物ＺＰ３１１进行菌液ＰＣＲ鉴定ꎬ以Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ有９份菌液扩增出条带ꎬ大小约为７１５ｂｐꎬ其中菌液ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ－１４的测序结果完全正确ꎬ成功构建种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ(图２Ｃ㊁图３)ꎮＭ:ＤＮＡ分子量参考ꎻ阳:Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒阳性对照ꎮ图２㊀ＳｌＯＬＥ１基因全长(Ａ)㊁ＴａｇＲＦＰ编码区片段(Ｂ)以及ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ菌液(Ｃ)的ＰＣＲ扩增图３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ表达载体示意图２.３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转基因阳性番茄植株获得将ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ以番茄ＭＭ的子叶为外植体进行侵染ꎬ经组织培养共获得４５个再生植株ꎮ以转基因植株的ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７对ＴａｇＲＦＰ基因进行ＰＣＲ检测ꎮ以ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ野生型ＭＭ为阴性对照ꎬ水为空白对照ꎬ结果(图４)显示ꎬ有８株Ｔ０代番茄植株的扩增产物与野生型ＭＭ一致ꎬ为单一条带ꎬ表明没有插入ＴａｇＲＦＰ基因ꎻ其余３７株均扩增出杂合条带ꎬ表明成功插入了ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ遗传转化效率达到８２.２２％ꎮ图４㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰＴ０代转基因植株的ＰＣＲ鉴定２.４㊀转基因番茄后代种子红色荧光观察及ＰＣＲ鉴定挑选９株生长健壮的ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ阳性转基因番茄幼苗ꎬ移栽至玻璃温室ꎬ振荡自交授粉ꎮ将Ｔ０代植株自交种子干燥后置于徕卡体视荧光显微镜下ꎬ以野生型ＭＭ的种子为阴性对照ꎬ分别在明场和荧光光源下检测ＴａｇＲＦＰ信号ꎮ结果(图５)显示ꎬ在明场下ꎬ野生型ＭＭ和转基因干燥种子颜色无明显差异ꎻ在荧光下ꎬ野生型种子均无红色荧光ꎬ转基因种子部分呈现明亮红色荧光ꎮ表明ＴａｇＲＦＰ可以作为一种标记筛选出转基因番茄后代中的红色荧光种子ꎮ５㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代图５㊀野生型ＭＭ和Ｔ０代转基因植株自交种子的ＴａｇＲＦＰ荧光检测㊀㊀为了验证通过种子红色荧光检测番茄转基因后代的准确性ꎬ进一步播种转基因植株的红色荧光种子和无荧光种子各９６粒ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７进行ＰＣＲꎬ鉴定后代植株是否存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎮ结果表明ꎬ９６株红色荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为杂合条带ꎬ表明含有ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ而９６株无荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为单一条带ꎬ表明不含ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎮ荧光种子和无荧光种子各１２粒萌发的幼苗ＰＣＲ检测结果如图６所示ꎬ表明通过种子红色荧光鉴定番茄转基因后代的准确率达１００％ꎮ图６㊀红色荧光(Ａ)和无荧光(Ｂ)种子的ＰＣＲ检测３㊀讨论与结论荧光蛋白有多种类型ꎬ其中ꎬ绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)㊁蓝色荧光蛋白(ＢＦＰ)㊁青色荧光蛋白(ＣＦＰ)和黄色荧光蛋白(ＹＦＰ)等[２１－２４]的发射波长局限在４４０~５２９ｎｍ[２５]ꎬ在细胞内成像时会激发某些内源物质产生荧光ꎬ对结果造成不同程度的干扰ꎮ本研究所使用的ＴａｇＲＦＰ的发射波长为５８４ｎｍꎬ细胞内成像背景低ꎬ更容易检测ꎮ通过ＰＣＲ分子标记检测发现ꎬ利用ＴａｇＲＦＰ作为筛选标记ꎬ区分转基因与非转基因种子的准确率可达１００％ꎮ此外ꎬ使用荧光蛋白标记筛选转基因种子时ꎬ可利用荧光种子分选设备进一步提高鉴定效率[２６－２７]ꎮ种子特异性表达启动子驱动荧光蛋白基因ꎬ可用于转基因种子的可视化鉴定ꎮ在拟南芥中使用种子储藏蛋白基因ｎａｐｉｎ启动子驱动荧光蛋白进行表达ꎬ可以在荧光显微镜下识别转基因种子[２８]ꎮ拟南芥和水稻油体蛋白基因ＡｔＯＬＥ１㊁Ｏｓ￣ＯＬＥ４与ＧＦＰ的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因种子呈现绿色荧光ꎬ从而实现快速简便鉴定转基因后代[４ꎬ２０]ꎮ本研究发现ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)是拟南芥ＡｔＯＬＥ１基因和水稻ＯｓＯＬＥ４基因的同源基因ꎬ而且在番茄种子中特异㊁高水平表达ꎮ利用Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因启动子驱动ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ成功实现了通过种子红色荧光快速简便鉴定转基因番茄后代的目的ꎮ由此推测ꎬ利用植物自身种子特异性启动子驱动油体蛋白与荧光蛋白融合基因的表达ꎬ可以应用于其他含油体蛋白种子植物的转基因后代鉴定ꎮ种子荧光标记系统已经逐步应用于基础研究６山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀和育种领域ꎮ基因编辑通常借助稳定的遗传转化ꎬ需要对阳性转基因植株和不含转基因成分的突变后代进行筛选ꎬ工作量大ꎬ费用高ꎮ玉米种子荧光报告系统辅助的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ基因编辑技术通过胚中的红色荧光标记准确鉴别转基因或非转基因籽粒ꎬ显著提高了基因编辑工作效率[２９]ꎮ水稻智能不育育种技术将育性恢复基因㊁花粉失活基因和种子特异启动子驱动的红色荧光蛋白基因串联ꎬ一起导入到水稻雄性不育突变体中ꎬ自交可产生无荧光的雄性不育种子和有荧光的可育种子[３０]ꎮ玉米雄性不育制种新技术也可根据红色荧光实现不育系和保持系种子的分选[３１]ꎮ利用单倍体诱导系的单倍体育种技术可以加快纯系选育进程ꎬ提高育种效率ꎮ然而单倍体诱导效率一般不高ꎬ鉴别也较为困难ꎮ利用基因编辑技术创制拟南芥㊁玉米和马铃薯等植物的单倍体诱导系ꎬ结合种子荧光标记ꎬ提高了单倍体鉴别效率[３２－３３]ꎮＺｈｏｎｇ等[３４]报道的番茄单倍体荧光鉴别技术体系中使用的是拟南芥ＦＡＳＴ￣Ｒｅｄ标记ꎮ本研究克隆了番茄自身的种子特异性表达基因ＳｌＯＬＥ１ꎬ并构建了ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎮ稳定遗传转化ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因的番茄种子在激发光照射下发出明亮的红色荧光ꎬ准确率可达１００％ꎮ该种子红色荧光标记筛选体系将有望应用于番茄基因编辑㊁智能雄性不育系创制和单倍体鉴别等领域ꎬ具有一定基础研究和育种应用价值ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＯｒｔｉｚＪＰꎬＲｅｇｇｉａｒｄｏＭＩꎬＲａｖｉｚｚｉｎｉＲＡꎬｅｔａｌ.Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅａｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｗｈｅａｔｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓ￣ｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１５ꎬ１５(１２):８７７－８８１. [２]㊀ＮａｋａｍｕｒａＳꎬＭａｎｏＳꎬＴａｎａｋａＹꎬｅｔａｌ.Ｇａｔｅｗａｙｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｔｈｅｂｉａｌａｐｈｏｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅꎬｂａｒꎬａｓａｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍ￣ｉｓｔｒｙꎬ２０１０ꎬ７４(６):１３１５－１３１９.[３]㊀ＳｈｉｖａＰｒａｋａｓｈＮꎬＢｈｏｊａｒａｊａＲꎬＳｈｉｖｂａｃｈａｎＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｏｒｎｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｃｏ￣ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００９ꎬ２８(１１):１６５５－１６６８. [４]㊀ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ａｒａｐｉｄａｎｄｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｓｅｅｄｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１０ꎬ６１(３):５１９－５２８.[５]㊀ＪａｃｈＧꎬＢｉｎｏｔＥꎬＦｒｉｎｇｓＳꎬｅｔａｌ.ＵｓｅｏｆｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ.(ｄｓＲＥＤ)ａｓａｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｇｅｎｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ２８(４):４８３－４９１. [６]㊀ＭｉｚｕｎｏＨꎬＳａｗａｎｏＡꎬＥｌｉＰꎬｅｔａｌ.ＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａａｓａｆｕｓｉｏｎｔａｇａｎｄａｐａｒｔｎｅｒｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏ￣ｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ４０(８):２５０２－２５１０.[７]㊀ＹａｒｂｒｏｕｇｈＤꎬＷａｃｈｔｅｒＲＭꎬＫａｌｌｉｏＫꎬｅｔａｌ.ＲｅｆｉｎｅｄｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤｓＲｅｄꎬａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｃｏｒａｌꎬａｔ２.０￣Åｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２００１ꎬ９８(２):４６２－４６７. [８]㊀ＪａｃｈＧꎬＰｅｓｃｈＭꎬＲｉｃｈｔｅｒＫꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍＲＦＰ１ａｄｄｓｒｅｄｔｏｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００６ꎬ３(８):５９７－６００.[９]㊀ＮｉｓｈｉｚａｗａＫꎬＫｉｔａＹꎬＫｉｔａｙａｍａＭꎬｅｔａｌ.Ａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏ￣ｔｅｉｎꎬＤｓＲｅｄ２ꎬａｓａｖｉｓｕａｌｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００６ꎬ２５(１２):１３５５－１３６１.[１０]ＭａｔｚＭＶꎬＦｒａｄｋｏｖＡＦꎬＬａｂａｓＹＡꎬｅｔａｌ.ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＡｎｔｈｏｚｏａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ１７(１０):９６９－９７３.[１１]ＭｅｒｚｌｙａｋＥＭꎬＧｏｅｄｈａｒｔＪꎬＳｈｃｈｅｒｂｏＤꎬｅｔａｌ.Ｂｒｉｇｈｔｍｏｎｏ￣ｍｅｒｉｃｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｎｅｘｔｅｎｄｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｉｆｅ￣ｔｉｍｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００７ꎬ４(７):５５５－５５７.[１２]ＲｏｏｉｊｅｎＧＪＨꎬＭｏｌｏｎｅｙＭＭ.Ｐｌａｎｔｓｅｅｄｏｉｌ￣ｂｏｄｉｅｓａｓｃａｒｒｉｅｒｓｆｏｒｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１３(１):７２－７７. [１３]ＨｕａｎｇＡＨ.Ｏｌｅｏｓｉｎｓａｎｄｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｓ[Ｊ].Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ１１０(４):１０５５－１０６１.[１４]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＨａｙａｓｈｉＭꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ｍｅｍｂｒａｎｅｄｙｎａｍ￣ｉｃｓａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｌｅａｖｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７６(１):１９９－２０７.[１５]ＣｈｅｎＫꎬＹｉｎＹＴꎬＬｉｕＳꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｓｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ.[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９４.[１６]ＹｕａｎＹＣꎬＣａｏＸＺꎬＺｈａｎｇＨＪꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｆｏｕｒｃｏｔｔｏｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｉｔｓｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｏｉｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ２１(１):５６９.[１７]ＤｏｙｌｅＪＪꎬＤｏｙｌｅＪＬ.ＡｒａｐｉｄＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｓｍａｌｌｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｅａｆｔｉｓｓｕｅ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎꎬ１９８７ꎬ１９:１１－１５.[１８]杨孟霞.利用基因编辑技术创制番茄雄性不育材料的研究[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０２０.[１９]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＴａｋａｈａｓｈｉＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｒｏｌｅｆｏｒｏｌｅｏｓｉｎｓｉｎｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｏｉｌｓｅｅｄｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００８ꎬ５５(５):７９８－８０９.[２０]ＳｈｉｍａｄａＴꎬＯｇａｗａＹꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＯｓＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｓｅｅｄｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ２０１１ꎬ６(１０):１４５４－１４５６.[２１]ＴｓｉｅｎＲＹ.Ｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆ７㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９９８ꎬ６７:５０９－５４４.[２２]ＰａｔｔｅｒｓｏｎＧＨꎬＤａｙＲＮꎬＰｉｓｔｏｎＤＪ.Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｅｃｔｒａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ１１４(５):８３７－８３８. [２３]ＲｉｚｚｏＭＡꎬＳｐｒｉｎｇｅｒＧＨꎬＧｒａｎａｄａＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｃｙａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｖａｒｉａｎｔｕｓｅｆｕｌｆｏｒＦＲＥＴ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ２２(４):４４５－４４９.[２４]ＧｒｉｅｓｂｅｃｋＯꎬＢａｉｒｄＧＳꎬＣａｍｐｂｅｌｌＲＥꎬｅｔａｌ.Ｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｎ￣ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ２７６(３１):２９１８８－２９１９４.[２５]樊晋宇ꎬ崔宗强ꎬ张先恩.红色荧光蛋白的光谱多样性及体外分子进化[Ｊ].生物化学与生物物理进展ꎬ２００８ꎬ３５(１０):１１１２－１１２０.[２６]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.一种用于荧光种子分选的光学装置:ＣＮ１１５１４４３３０Ａ[Ｐ].２０２１－０３－３０. [２７]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.荧光种子分选装置:ＣＮ２１４７１８４８２Ｕ[Ｐ].２０２１－１１－１６.[２８]ＳｔｕｉｔｊｅＡＲꎬＶｅｒｂｒｅｅＥＣꎬｖａｎｄｅｒＬｉｎｄｅｎＫＨꎬｅｔａｌ.Ｓｅｅｄ￣ｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｓｆｏｒｅａｓｙ(ｃｏ)ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｉｎＡｒａ￣ｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００３ꎬ１(４):３０１－３０９.[２９]ＹａｎＹＹꎬＺｈｕＪＪꎬＱｉＸＴꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｐｏｒｔｅｒ￣ａｓｓｉｓｔｅｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ６３(９):１６７１－１６８０.[３０]ＣｈａｎｇＺＹꎬＣｈｅｎＺＦꎬＷａｎｇＮꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒｈｙｂｒｉｄｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｕ￣ｓｉｎｇａｎｕｃｌｅａｒｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｇｅｎｅ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａ￣ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１６ꎬ１１３(４９):１４１４５－１４１５０.[３１]ＣａｉＤＲꎬＺｈａｎｇＺＧꎬＺｈａｏＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｈｙｂｒｉｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂａｓｅｄｏｎａｕｎｉｌａｔｅｒａｌｃｒｏｓｓ￣ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２３ꎬ６６(３):５９５－６０１.[３２]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＬｉＭＲꎬｅｔａｌ.ＡＤＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓＡｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｌａｎｔｓꎬ２０２０ꎬ６(５):４６６－４７２.[３３]ＺｈａｎｇＪＺꎬＹｉｎＪꎬＬｕｏＪＹꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｄｉｐ￣ｌｏｉｄｐｏｔａｔｏｔｈｒｏｕｇｈｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ａＢＩＯＴＥＣＨꎬ２０２２ꎬ３(３):１６３－１６８.[３４]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＷａｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎ￣ｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２２ꎬ２０(２):２５０－２５２.８山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀。
农作物种子纯度检测技术研究进展
诤 脚 鏖 鼹 礴
河 南省 种子 管 理站 赵 侠科 李 延 峰
种 子是有 生命 的特殊农业 生产 资 料 ，是实现 农业科 技进步 的载体 ，其 质量好坏 直接关 系到优 良良种增产 潜 力的发挥 和农业 生产 的安 全。在衡 量 种子质量的纯度、净度、发芽率和水 分４ 项 指标 中 ， 尤其以纯度最为重要 ， 它直 接影响农 作物的产 量和农 民的效 益。传统 的种 子纯度检验 方法有籽 粒 形态鉴 定 、幼苗鉴 定和 田间小 区种 植 鉴定 ，前两种鉴 定方法简 单方便但 不 太确 定 ，故很 少使用 。第 ３种方 法虽 然较 前两种方 法准确 可靠 ，但是 所需 时间长 、费 用高 ，不能 及时了解和 评 价种 子质 量 ，其实上 述 ３ 种方 法有一 个共 同的缺点 ，就是检 测结果容 易受 人 为 因 素 的 影 响。２ ０ ０ ０ 年 ，农 业 部 颁布 了农业 行业标准 《 玉米种 子纯度 盐溶 蛋白 电泳 鉴定方法 》 （ ＮＹ ／ Ｔ ４ ４ ９ ． ２ ０ ０ １ ），在一 定程度上解 决 了杂 交玉 米种 子纯度快 速检测 的问题 ，取得 了 良好 的效 果。但由于 蛋白 电泳 方法 的 局 限性 ，未 能从根本 上解决 问题。 生 物 技 术 的发 展 ，诞 生 了 一 系列 Ｄ Ｎ Ａ 分子标记 技术 ，给作 物遗传育 种研究 带来 了巨大的变化 ，同时也 给种子 纯 度及品种 真实性鉴 定工作 提供 了一种
此法 是指利用 电泳技术对 备检样 品的种子 或幼苗 的蛋 白质 进行分 离、 染色 ，形 成蛋 白质 电泳谱 带的 差异 ， 并与标准 品种相 比较 ，从 而鉴定 品种 的真实性 和纯度 的一种 方法。不 同作 物品种 ，基因不 同 ，基 因的直接表 达 产物—— 蛋 白质 在种类 、数量 、结构 等方 面亦不 同。该 法是利 用蛋 白质 的 多态 性来 反 映不 同品种 Ｄ ＮＡ 组成 上 的差 异 ，从而进 行品种 鉴定 。该 法快 速 、可靠 ，不 受环境 影响。 （ ～ ）同工酶电泳法 同工酶 是指来源相 同 、催 化相同 反应 而结构不 同 的酶 分子类 型 ，具组 织 、发 育和 品种 间特 异性 。该 法是指 利 用电泳技 术 （ 包括 聚丙烯酰 胺凝胶 电泳、淀粉 胶电泳等 ）来分 离各种酶 的同工酶 ，通过 比较 同工 酶 ，来确 定 作 物种子 的纯度 。目前 ，在作 物种 子 纯 度鉴定 中 ，最常 用的 、多态 性较强 的是酯酶和 过氧 化物酶 ，所用方法 多 为聚丙 烯酰胺 凝胶 电泳法。Ｑｕ ｉ ｌ ｌ ｅ ｔ 等 （ １ ９ ９ ２ ）研 究 了 地 理 起 源 不 同的 ５ ２ 个 向 日葵 自交 系的 ８个 同工酶 系统 ，
番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):１４５~１５０ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.０１８收稿日期:２０２３－０６－０７基金项目:山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０２０ＱＣ１５２)ꎻ山东省重点研发计划农业良种工程项目(２０２２ＬＺＧＣ００９)ꎻ中央引导地方科技发展专项资金项目(ＹＤＺＸ２０２２１３６)作者简介:苏晓梅(１９８８ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事番茄遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｓｘｍ１９８８４６＠１２６.ｃｏｍ通信作者:侯丽霞(１９７０ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事番茄遗传育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｏｕｌｘ２００６＠１２６.ｃｏｍ番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选苏晓梅ꎬ王梦蕊ꎬ吕宏君ꎬ刘淑梅ꎬ王施慧ꎬ侯丽霞(山东省农业科学院蔬菜研究所/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/国家蔬菜改良中心山东分中心ꎬ山东济南㊀２５０１００)㊀㊀摘要:番茄颈腐根腐病是设施番茄冬春生产中最严重的病害之一ꎬ严重威胁我国设施番茄的安全生产ꎮ近年来番茄颈腐根腐病在我国番茄主产区发生日益严重ꎬ培育抗病品种是防治该病最经济有效的方法ꎮ本试验采集典型症状的发病植株进行病原菌分离纯化ꎬ综合运用形态学观察㊁分子生物学鉴定和致病性测定方法ꎬ确定病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉꎬＦｏｒｌ)ꎮ之后利用分离的病原菌通过苗期人工接种鉴定结合抗性基因分子标记方法ꎬ对３２个番茄商品种进行抗颈腐根腐病鉴定分析ꎬ结果显示有１８个表现抗病ꎬ与分子标记Ｆｒｌ－ＺＬ的鉴定结果一致ꎬ可用于番茄抗颈腐根腐病育种或生产ꎮ关键词:番茄ꎻ颈腐根腐病ꎻ抗性鉴定ꎻ分子标记中图分类号:Ｓ４３６.４１２.１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－０１４５－０６ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＣａｕｓｉｎｇＦｕｓａｒｉｕｍＣｒｏｗｎａｎｄＲｏｏｔＲｏｔａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇＲｅｓｉｓｔａｎｔＶａｒｉｅｔｉｅｓｉｎＴｏｍａｔｏＳｕＸｉａｏｍｅｉꎬＷａｎｇＭｅｎｇｒｕｉꎬＬｙｕＨｏｎｇｊｕｎꎬＬｉｕＳｈｕｍｅｉꎬＷａｎｇＳｈｉｈｕｉꎬＨｏｕＬｉｘｉａ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＧｒｅｅｎｈｏｕｓｅＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＢｒａｎｃｈｏｆＮａｔｉｏｎａｌＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒｆｏｒＶｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔ(ＦＣＲＲ)ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｓｅｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｔｈｒｅａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｅｄｔｏｍａｔｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎａ.ＩｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＦＣＲＲｉｓｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｉｎｔｈｅｍａｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｒｅａｓｏｆｔｏｍａｔｏｉｎＣｈｉｎａ.Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｓｔ￣ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓｂｙｔｉｓｓｕｅ￣ｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ.Ｂａｓｅｄｏｎｍｏｒｐｈｏ￣ｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎬｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｔｅｓｔꎬｔｈｅｃａｕｓａｌｐａｔｈｏｇｅｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ(Ｆｏｒｌ).ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓａｇａｉｎｓｔＦｏｒｌｉｎｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎꎬｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆ３２ｖａｒｉｅｔｉｅｓｔｏＦｏｒｌｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎａｔｓｅｅｄｌｉｎｇｓｔａｇｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ￣ａｓｓｉｓｔｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｒｌｇｅｎｅ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄ１８ｍａｔｅｒｉａｌｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔ￣ａｎｃｅｔｏＦＣＲＲꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｕｓｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒＦｒｌ￣ＺＬ.Ｔｈｅｓｅｓｅ￣ｌｅｃｔｅｄｖａｒｉｅｔｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｏｍａｔｏｗｉｔｈＦＣＲＲｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＴｏｍａｔｏꎻＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔꎻＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻＭｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ㊀㊀番茄颈腐根腐病(ＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔꎬＦＣＲＲ)ꎬ俗称 死棵病 ꎬ是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉꎬＦｏｒｌ)引起的番茄土传性真菌病害[１]ꎬ能够造成番茄黄化萎蔫㊁发育不良和根茎腐烂ꎮ该病害在设施栽培地区发生严重ꎬ尤其是连作栽培导致病原菌在土壤中富集ꎬ对设施番茄生产造成严重影响[２－５]ꎮ近年来ꎬ番茄颈腐根腐病已成为威胁我国设施番茄冬春生产的最重要病害之一ꎬ侵染后可造成番茄严重减产甚至绝收[６－８]ꎮ此病侵染周期相对较长ꎬ早期不易发现ꎬ目前还没有十分安全有效的物理和化学防治方法[９]ꎮ相对来说ꎬ培育和利用抗病品种是防治该病害最为经济有效的措施ꎮ国外开展番茄颈腐根腐病抗性鉴定工作较早ꎬ并且在抗性基因定位和分子标记开发应用方面也取得一定的进展[１０－１４]ꎮ然而我国有关番茄颈腐根腐病的研究报道较少ꎬ且多数集中在该病害的发生和病原菌鉴定方面ꎬ而在抗性资源筛选研究方面还相对落后ꎬ抗病育种工作进展也较为缓慢ꎮ本研究采集山东省内不同地区番茄发病植株进行病原菌分离纯化ꎬ之后采用形态学观察㊁分子生物学鉴定和致病性测定方法对其进行鉴定ꎬ确定其为番茄颈腐根腐病菌后再利用苗期人工接种鉴定结合分子标记分析方法ꎬ对不同来源的３２个番茄商品种进行抗颈腐根腐病鉴定分析ꎬ以期为番茄抗颈腐根腐病育种和生产提供理论和技术依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试病株材料:于２０２０ ２０２２年对山东省济南市㊁聊城市㊁青岛市和威海市四地番茄颈腐根腐病田间发病症状进行调查ꎬ采集番茄颈腐根腐病病株组织ꎬ带回实验室进行病原菌分离鉴定ꎮ抗性鉴定材料:试验所用鉴定材料共３２个番茄商品种ꎬ由育种公司惠赠或市场购买ꎮ抗病对照ＬＡ３２７３和感病对照Ｈｅｉｎｚ１７０６来自番茄遗传资源中心(ＴｏｍａｔｏＧｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒꎬＴＧＲＣ)ꎬ由山东省农业科学院蔬菜研究所番茄课题组收集保存ꎮ试验于２０２３年４ ５月在蔬菜所实验楼土培室中进行ꎮ以上材料各选取１２粒饱满无病种子ꎬ在２８ħ恒温箱中催芽ꎬ待露白后播种于基质土中ꎬ每个品种播种８株ꎬ２４~２８ħ培养室内育苗ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀病原菌分离与形态观察㊀采用常规组织分离法对病原菌进行分离纯化[１５]ꎮ将染病植株根部冲洗干净ꎬ于超净工作台中将植株病健交界处组织切为大小约３ｍｍˑ３ｍｍ的茎段ꎬ用７５％酒精消毒２０ｓ后无菌水冲洗１次ꎬ然后用１％Ｎａ￣ＣｌＯ对病茎消毒５ｍｉｎ后无菌水冲洗４~５次ꎬ最后将该组织置于马铃薯葡萄糖琼脂(ＰＤＡ)培养基上ꎬ每皿放置２~３块ꎬ于２５ħ恒温培养箱中黑暗培养ꎮ病原菌长出后ꎬ选取疑似番茄颈腐根腐病病原菌菌落转接至新的ＰＤＡ培养基上ꎬ于２５ħ培养箱内黑暗培养ꎬ直至菌落外观均一ꎮ将纯化的病原菌于显微镜下观察鉴定ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２.２㊀病原菌分子生物学鉴定㊀将分离纯化后的病原菌挑至马铃薯葡萄糖(ＰＤ)液体培养基中ꎬ２５ħ条件下１２０ｒ/ｍｉｎ振荡培养４ｄꎬ过滤收集菌丝体ꎬ冻干后提取菌株基因组ＤＮＡꎮ利用ＩＴＳ通用引物(ＩＴＳ１:ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧꎻＩＴＳ４:ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ)和根据ＮＣＢＩ中Ｆｏｒｌ序列设计引物(Ｆ:ＣＴＣＣＧＡＣＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＣ￣ＴＡＴＧꎻＲ:ＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＧＴＧＴＡＡ)对病原菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增产物经１.５％琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京六合华大基因科技有限公司测序ꎮ利用ＮＣＢＩ数据库的Ｂｌａｓｔ程序对测序结果进行比对ꎮ１.２.３㊀病原菌致病性测定㊀病原菌在ＰＤ培养基中振荡培养４ｄ后ꎬ用无菌水配成浓度为１ˑ１０７个/ｍＬ的孢子悬浮液ꎮ以感病番茄材料Ｈｅｉｎｚ１７０６为接种对象ꎬ采用浸根法回接番茄幼苗ꎬ同时以清水接种作为对照ꎮ接种后控制温度为２０ħꎬ相对湿度为５０％~６０％ꎬ正常栽培管理ꎮ待植株发病后再次进行病原菌分离与纯化ꎬ观察其菌落外观形态ꎬ镜检菌丝与孢子形态ꎮ１.２.４㊀番茄品种抗病性鉴定㊀分别以ＬＡ３２７３和Ｈｅｉｎｚ１７０６为抗感病对照ꎬ参照王梦蕊等[１５]的浸根法对３２个番茄商品种进行接种鉴定ꎮ接种后置于１８~２２ħ室内环境中培养ꎬ４周后调查发病情况ꎮ１.２.５㊀番茄品种分子标记检测㊀每个编号的番茄品种混合取样ꎬ采用ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡꎬ使用与Ｆｒｌ基因连锁的分子标记ＰＮＵ－６４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀Ｄ４[１３](Ｆ:ＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＣＣＣＡꎻＲ:ＴＧＡＴ￣ＣＡＴＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡ)和Ｆｒｌ－ＺＬ[１６](Ｆ:ＡＣＡＡＴ￣ＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧꎻＲ:ＣＣＴＡＡＡＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧ)对番茄品种进行ＰＣＲ扩增分析ꎮＰＮＵ－Ｄ４的ＰＣＲ产物经ＭｂｏⅠ酶切后用２％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀番茄颈腐根腐病发病症状调查发现ꎬ番茄颈腐根腐病常发生于保护地冬春季番茄生产中ꎬ成株期发生时出现植株下部叶片黄化和植株直立而萎蔫的症状ꎬ萎蔫最早出现在一天最暖和的时候ꎬ晚上恢复ꎮ该病最明显的特征为茎基部缢缩且呈深褐色ꎬ主根部分或全部腐烂脱落ꎻ病株根部纵向剖面可以看到广泛的褐变和腐烂现象ꎬ维管束呈褐色并向地上部延伸ꎬ高度不超过土壤线上２５ｃｍ(图１)ꎮ２.２㊀病原菌鉴定２.２.１㊀病原菌形态学鉴定㊀在ＰＤＡ培养基中于２５ħ黑暗条件下进行恒温培养ꎬ结果(图２)看出ꎬ病原菌呈灰白色或粉紫色ꎬ菌落圆形㊁平铺生长ꎬ菌丝绒毛状ꎬ培养５ｄ菌落直径６０ｍｍ左右ꎮ病原菌主要产生三种类型的孢子:小分生孢子㊁大分生孢子和厚垣孢子ꎮ小分生孢子数量最多ꎬ呈长椭圆形或纺锤形ꎻ大分生孢子呈镰刀形ꎬ有２~４个分隔ꎻ厚垣孢子为透明状球形ꎬ顶生或间生于短侧枝上ꎬ多为单独生长ꎬ偶尔也对生或串生ꎮ该形态与其他研究者[１７－１８]描述的尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型相一致ꎬ可初步确定该病原菌为尖孢镰刀菌ꎮ图１㊀番茄颈腐根腐病田间病株(左)和根茎纵切面(右)Ａ:菌落形态ꎻＢ:分生孢子ꎻＣ:厚垣孢子与孢子梗ꎮ图２㊀菌株的菌落形态与显微形态２.２.２㊀病原菌分子生物学鉴定㊀使用真菌ＩＴＳ通用引物和Ｆｏｒｌ基因设计的引物对病原菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增ꎬ经检测分别获得５２０ｂｐ和１４００ｂｐ左右的条带(图３)ꎮ将ＰＣＲ产物测序后提交至ＮＣＢＩ进行Ｂｌａｓｔ比对ꎬ结果表明ꎬＩＴＳ１/４扩增产物与尖孢镰刀菌(ＫＹ０７３２５８.１)同源性为９９％以上ꎻＦｏｒｌ扩增产物与尖孢镰刀菌颈腐根腐病专化型(ＡＢ２０８０７３.１)的同源性为９９％以上ꎮ２.２.３㊀病原菌致病性测定㊀从不同地区分离到的４个菌株分别接种到感病番茄Ｈｅｉｎｚ１７０６上ꎬ接种后两周番茄幼苗下部叶片黄化ꎬ根部与茎基部褐化腐烂ꎬ表现为典型的番茄颈腐根腐病症状(图４)ꎮ从病株发病组织再次分离病原菌进行观察ꎬ其菌落形态和孢子形态与２.２.１中描述的菌株一致ꎮ结合病原菌形态观察和分子生物学鉴定ꎬ确认分离的病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐ￣ｅｒｓｉｃｉꎮ７４１㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀苏晓梅ꎬ等:番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选Ａ:ＩＴＳ扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱ꎻＢ:Ｆｏｒｌ－１扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱ꎻ１~４:不同地区分离出的病原菌菌株ꎮ图３㊀颈腐根腐病病原菌分子生物学鉴定图４㊀接种病原菌的番茄幼苗发病情况２.３㊀品种接种鉴定与分子标记检测采用苗期人工接种鉴定方法对３２个番茄商品种进行抗颈腐根腐病鉴定ꎬ接种后４周进行病情调查ꎬ确定抗性级别ꎬ鉴定结果如表１所示ꎮ其中ꎬ表现抗病的品种有１８个ꎬ包括来自伟丽公司的４个砧木以及其他公司选育的栽培品种ꎬ这些材料可用于番茄抗颈腐根腐病生产ꎮ使用基因连锁标记ＰＮＵ－Ｄ４和Ｆｒｌ－ＺＬ对３２个番茄商品种进行分析ꎬ结果(图５)显示ꎬ标记ＰＮＵ－Ｄ４检测结果中有２８个与接种鉴定结果一致ꎬ该标记的准确率为８７.５％ꎻ标记Ｆｒｌ－ＺＬ检测结果与接种鉴定结果完全一致ꎬ准确率为１００％ꎬ表明该标记可用于番茄抗颈腐根腐病辅助育种ꎮ表１㊀３２个番茄品种人工接种鉴定与分子标记检测结果序号品种名称来源类型果重/ｇ标记ＰＮＵ－Ｄ４标记Ｆｒｌ－ＺＬ人工接种鉴定结果１天妃十一沈阳谷雨粉果２５０~２８０ＨＨ抗病２卓粉一号沈阳谷雨粉果２５０ＨＳ感病３天宝３２６沈阳谷雨粉果２５０~３００ＨＳ感病４天赐５９５沈阳谷雨粉果３００~３５０ＳＳ感病５冠群七号南澳绿亨粉果２８０ＨＨ抗病６吉丽二号南澳绿亨粉果２５０~２８０ＳＳ感病７喜旺二号南澳绿亨粉果２８０~３００ＨＨ抗病８粉抗四号南澳绿亨粉果２６０~２８０ＳＳ感病９普金９０１南澳绿亨粉果２４０~２６０ＳＳ感病１０鲜美五号南澳绿亨口感１２０ＨＳ感病１１罗拉海泽拉粉果２４０~２７０ＨＨ抗病１２安纳西海泽拉粉果２４０~２６０ＳＨ抗病１３桃乐丝海泽拉红果２００~２４０ＨＨ抗病１４圣罗兰海泽拉粉果２００~２４０ＨＨ抗病１５瑞拉海泽拉粉果２２０~２４０ＳＳ感病１６齐达利先正达红果２２０ＳＳ感病１７瑞菲先正达红果２００ＳＳ感病１８冬暖先正达红果２００ＳＳ感病１９凯利３号先正达红果２００ＨＨ抗病２０思贝德先正达红果２００ＳＳ感病２１丰收１２８宁夏巨丰粉果２００~２５０ＨＨ抗病２２意佰芬－５宁夏巨丰粉果２５０ＨＨ抗病８４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀表１(续)序号品种名称来源类型果重/ｇ标记ＰＮＵ－Ｄ４标记Ｆｒｌ－ＺＬ人工接种鉴定结果２３沃粉２号宁夏巨丰粉果２５０ＳＳ感病２４凯德雅丽８７３６０宁夏巨丰粉果２８０ＨＨ抗病２５砧如意伟丽种苗砧木 ＲＲ抗病２６砧爱一号伟丽种苗砧木 ＨＨ抗病２７ＲＴ１７０３伟丽种苗砧木 ＲＲ抗病２８Ｄ６０９伟丽种苗砧木ＨＨ抗病２９诺粉３０９艾维特粉果２８０ＨＨ抗病３０京番３０９京研益农口感８０~１２０ＳＳ感病３１喜来德１号纽内姆粉果２２０~２７０ＨＨ抗病３２托瑞德澳特粉果１６０~１８０ＨＨ抗病３３ＬＡ３２７３ＴＧＲＣ抗病对照 ＲＲ抗病３４Ｈｅｉｎｚ１７０６ＴＧＲＣ感病对照 ＳＳ感病㊀㊀注:Ｈ表示杂合抗病ꎬＲ表示抗病ꎬＳ表示感病ꎬ 表示无数据ꎻ果重为单一数值时表示果重为该数值左右ꎮＭ:ＤＮＡｌａｄｄｅｒꎬ１００ｂｐꎻＨ:杂合型ꎬＲ:抗病型ꎬＳ:感病型ꎻＬＡ３２７３(３３)和Ｈｅｉｎｚ１７０６(３４)分别为抗感病对照ꎻ１~３２为番茄商品种ꎮ图５㊀分子标记ＰＮＵ－Ｄ４(Ａ)和Ｆｒｌ－ＺＬ(Ｂ)在３２个番茄商品种中的扩增检测结果３㊀讨论与结论我国是番茄生产大国ꎬ近年来随着设施栽培面积的不断增大ꎬ多地出现颈腐根腐病危害番茄生产的报道ꎬ该病已成为威胁我国设施番茄生产的重要病害之一ꎮ目前生产上对番茄颈腐根腐病认识不足ꎬ常与枯萎病㊁青枯病等混称为 死棵 病ꎬ难以采取针对性的防治措施ꎮ病原菌的分离鉴定是确定病害类型并进行有效防治的前提ꎮ本研究对在山东省不同地区采集的疑似番茄颈腐根腐病病株进行病原菌分离ꎬ通过形态学特征观察㊁分子生物学鉴定和致病性测定方法鉴定分离得到的病原菌为番茄颈腐根腐病专化型Ｆｏｒｌꎮ随着分子生物学的发展ꎬ分子标记辅助选择已成为番茄育种过程中不可或缺的一种技术手段ꎬ可以有效缩短育种时间ꎬ提高育种效率ꎮ然而其准确性取决于分子标记与目标基因的连锁程度ꎮ目前应用于番茄抗颈腐根腐病育种的分子标记有Ｃ２－２５和ＰＮＵ－Ｄ４ꎮ程琳等[６]通过人工接种结合分子标记Ｃ２－２５方法对２５份番茄种质材料进行鉴定ꎬ结果表明标记Ｃ２－２５的准确率为１００％ꎬ然而在王梦蕊等[１５]的研究中ꎬ该标记的准确率仅为５９％ꎬ其原因可能在于不同研究者使用的材料遗传背景不同ꎮ２０１６年ꎬＫｉｍ等[１３]筛选获得一个ＣＡＰＳ标记ＰＮＵ－Ｄ４ꎬ其在Ｆ２群体及６０份商品种番茄中的准确率分别为９２.８％和９０％ꎬ在王梦蕊等[１５]的研究中ꎬＰＮＵ－Ｄ４在５１份杂交种中鉴定的准确率为８６％ꎬ在本研究中该标记的准确率为８７.５％ꎬ与前人结果基本一致ꎮ随着Ｆｒｌ基因定位与克隆的研究进展ꎬ李传友等[１６]开发了一个ＳＣＡＲ标记Ｆｒｌ－ＺＬꎬ本研究中该标记在３２个商品种抗病鉴定中的准确率为１００％ꎬ表明该标记可用于番茄抗颈腐根腐病辅助育种ꎮ接下来还需进一步加强Ｆｒｌ基因的克隆研究ꎬ为明确番茄抗颈腐根腐病分子机理和加快新品种选育奠定基础ꎮ９４１㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀苏晓梅ꎬ等:番茄颈腐根腐病病原菌鉴定及抗性品种筛选参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＪａｒｖｉｓＷＲꎬＳｈｏｅｍａｋｅｒＲＡ.ＴａｘｏｎｏｍｉｃｓｔａｔｕｓｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｏｘ￣ｙｓｐｏｒｕｍｃａｕｓｉｎｇｆｏｏｔａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏ[Ｊ].Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ￣ｇｙꎬ１９７８ꎬ６８(１２):１６７９－１６８０.[２]㊀ＳｏｎｏｄａＲＭ.ＯｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆａＦｕｓａｒｉｕｍｒｏｏｔ￣ｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏｅｓｉｎＳｏｕｔｈＦｌｏｒｉｄａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒꎬ１９７６ꎬ６０:２７１－２７４.[３]㊀ＪａｒｖｉｓＷＲꎬＴｈｏｒｐｅＨＪꎬＭｅｌｏｃｈｅＲＢ.ＳｕｒｖｅｙｏｆｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｐｒａｃｔｉｃｅｓｉｎＥｓｓｅｘＣｏｕｎｔｙꎬＯｎｔａｒｉｏꎬｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏＦｕｓａｒｉｕｍｆｏｏｔａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅꎬ１９８３ꎬ６７:３８－４０.[４]㊀ＫｉｍＪＴꎬＰａｒｋＩＨꎬＨａｈｍＹＨꎬｅｔａｌ.ＣｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｔｏｍａｔｏｃａｕｓｅｄｂｙＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉ￣ｃｅｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉｉｎＫｏｒｅａ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ１７(５):２９０－２９４.[５]㊀Ｐｏｒｔａ￣ＰｕｇｌｉａＡꎬＴａｎｔｉＲꎬＭｉｆｓｕｄＤ.ＡｓｅｖｅｒｅｏｕｔｂｒｅａｋｏｆｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏｃａｕｓｅｄｂｙＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉｉｎＭａｌｔａ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａꎬ２００５ꎬ４４(３):３１９－３２１.[６]㊀程琳ꎬ张生ꎬ李艳青ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原菌鉴定与抗病种质材料的筛选[Ｊ].园艺学报ꎬ２０１６ꎬ４３(４):７８１－７８８. [７]㊀张尚卿ꎬ韩晓清ꎬ缪作清ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原鉴定及２种接种方法的评价[Ｊ].华北农学报ꎬ２０１７ꎬ３２(５):１２４－１２９.[８]㊀李潇ꎬ李雪萍ꎬ漆永红ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原鉴定及其品种抗性鉴定[Ｊ].甘肃农业大学学报ꎬ２０１９ꎬ５４(５):１２１－１２７.[９]㊀ＬｉｕＪＢꎬＧｉｌａｒｄｉＧꎬＳａｎｎａＭꎬｅｔａｌ.ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｏｆｔｏｍａｔｏａｎｄｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｂａｃ￣ｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｅｃｙｃｌｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｏｆｓｏｉｌｌｅｓｓｃｒｏｐｓ[Ｊ].Ｐｈｙ￣ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａꎬ２０１０ꎬ４９(２):１６３－１７１. [１０]ＦａｚｉｏＧꎬＳｔｅｖｅｎｓＭＲꎬＳｃｏｔｔＪＷ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ(Ｆｒｌ)ｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ１９９９ꎬ１０５:２０５－２１０.[１１]ＳｔａｎｉａｓｚｅｋＭꎬＳｚｃｚｅｃｈｕｒａＷꎬＭａｒｃｚｅｗｓｋｉＷ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒＣ２￣２５ｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏ￣ｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＦｒｌｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＣｚｅｃｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇꎬ２０１４ꎬ５０(４):２８５－２８７.[１２]ＭｕｔｌｕＮꎬＤｅｍｉｒｅｌｌｉＡꎬＩｌｂｉＨꎬｅｔａｌ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｏ￣ｄｏｍｉ￣ｎａｎｔＳＣＡＲｍａｒｋｅｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅａｇａｉｎｓｔｔｈｅＦｕｓａｒｉ￣ｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ.ｓｐ.ｒａｄｉｃｉｓ￣ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ[Ｊ].ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐ￣ｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１５ꎬ１２８(９):１７９１－１７９８.[１３]ＫｉｍＢꎬＫｉｍＮꎬＫｉｍＪＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｈｉｇｈ￣ｒｅｓｏｌｕ￣ｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇｍａｒｋｅｒｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｎｇＦｕｓａｒｉｕｍｃｒｏｗｎａｎｄｒｏｏｔｒｏｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].Ｇｅｎｏｍｅꎬ２０１６ꎬ５９(３):１７３－１８３. [１４]ＤｅｖｒａｎＺꎬＫａｈｖｅｃｉＥꎬＨｏｎｇＹꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒＦｒｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏｂｒｅｅｄｉｎｇ[Ｊ].Ｔｈｅｏ￣ｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１３１(１０):２０９９－２１０５. [１５]王梦蕊ꎬ刘淑梅ꎬ侯丽霞ꎬ等.番茄颈腐根腐病抗性鉴定技术的建立及抗性种质资源筛选[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２２ꎬ５５(４):７０７－７１８.[１６]李传友ꎬ赵伟ꎬ邓磊ꎬ等.与番茄抗颈腐根腐病基因Ｆｒｌ紧密连锁的分子标记及其应用:ＣＮ１１３９４３８２６Ｂ[Ｐ].２０２３－０５－０５.[１７]耿丽华ꎬ李常保ꎬ迟胜起ꎬ等.番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响[Ｊ].植物病理学报ꎬ２０１２ꎬ４２(５):４４９－４５５.[１８]李景富ꎬ孙亚莉ꎬ赵婷婷ꎬ等.番茄颈腐根腐病菌分离鉴定与生物学特性研究[Ｊ].东北农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４９(２):２２－３０.０５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀。
中药材种植 ppt课件
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ppt课件
中药材产地环境 根茎类: 幼苗期—需氮量大，适量的磷和少量的钾 根茎器官形成期—需钾量增加，适量的磷少量的氮
种子果实类： 幼苗期—氮多，磷钾少些 生殖生长期：需磷量增大，少氮
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ppt课件
中药材的栽培管理 生物学特性 1、植物形态 2、生长发育习性 不同植物具有不同的习性，在种植前要充分的了解，制定 相对应的方案 生长是植物体积和重量的量变过程 发育是植物一生中形态、结构、功能的质变过程 药用植物的个体发育从形态和生理上可分为三个阶段—胚胎 发生、营养器官发生和生殖器官发生 由营养器官发生阶段转到生殖器官发生阶段，各种药用植 物都需要特定的温、光等环境条件
后期
慢
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ppt课件
中药材的栽培管理 b:植物生长相关性 地上部分与地下部分— 相互协调 相互制约 顶芽与腋芽、主根与侧根— 顶端优势 杜仲—保持 黄连—修根（抑制） 营养生长与生殖生长的相关 —相互依存 相互制约 以麦冬为例： 生长发育习性 1、叶丛生长 2、根的抽生 3、块根形成
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ppt课件
中药材产地环境 中生植物—大多数陆生的药用植物 水生植物—泽泻、浮萍、金鱼藻 4、旱涝对药用植物的危害 旱—大气干旱，土壤干旱 叶片萎蔫，生长受阻，严重时死亡 抗旱性 涝—土壤水分过多，氧气缺乏 根及根茎类药材忌田间积水或土壤水分过 多，注意排水。
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ppt课件
中药材产地环境
空气 1、氧气—呼吸必要因素 空气中氧气浓度降低到20%以下，茎叶 呼吸速率开始下降 根系生长适宜的土壤含氧量为10%-15% 改良土壤，中耕松土 2、二氧化碳—光合作用的重要原料 光合作用的最适二氧化碳含量约为1%左右 空气中的仅为0.02%-0.03% 3、其他废气 有的敏感，有的净化
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幼苗鉴定图谱
概念图片
（概念）初生根发育不全、粗短、停滞、残缺、断裂。
（概念）初生根从顶端开裂、缩缢、细长、卷缩在种皮内、负向地性。
（概念）初生根玻璃状、有初次感染所引起的腐烂、仅有一条或缺失种子根。
．概念图片
（概念）胚轴缩短而变粗、不能形成块茎<仙客来属>、深度的裂缝或破裂、中部又宽的裂缝、缺失
（概念）胚轴缩缺失、缩缢、严重扭曲、过度弯曲、形成环状或螺旋形
（概念）胚轴缩细长、玻璃状、初次感染引起的腐烂
概念图片
（概念）子叶肿胀或卷曲、畸形、断裂、缺失、变色
（概念）子叶坏死、玻璃状、初次感染所引起的腐烂
（概念）子叶缩短而扭曲、收缩变小、弯曲、形成环状或略旋形、无明显的‘膝'、细长
概念图片
（概念）初生叶畸形、损伤、残缺
（概念）初生叶变色<坏死>、有初次感染而引起的腐烂、形态正常、但小于正常的1/4。
概念图片
（概念）顶芽畸形、损伤、残缺、有初次感染而引起的腐烂。
概念图片
（概念）芽鞘和第一片叶畸形、损伤、残缺、严重弯曲。
（概念）芽鞘形成环状或螺旋形、严重扭曲、裂缝长度从顶端量超过1/3，茎部开裂。
概念图片
（概念）茎部细长、有初生感染所引起的腐烂、延伸长度不积芽鞘的一半、残缺、撕裂或其它的畸形。
葱属图片
（葱属）子叶无‘膝'。
葱属图片
（葱属）幼苗呈玻璃体透明状。
花生图片
（花生）初生根矮化有足够的初生根、无足够的次生根。
（花生）初生根矮化、缺失。
（花生）初生根从顶部裂开。
．
（花生）初生根腐烂。
花生图片
（花生）下胚轴裂开。
（花生）下胚轴向下弯。
花生图片
（花生）顶芽受损。
花生图片
（花生）幼苗腐烂。
甜菜图片
（甜菜）初生根生长受抑制。
甜菜图片
（甜菜）初生感染。
（甜菜）再生感染。
．
（甜菜）再生感染。
油菜图片
（油菜）初生根矮化。
（油菜）初生根矮化。
．
（油菜）初生根受抑制。
（油菜）初生根缺失。
油菜图片
（油菜）下胚轴向下弯。
瓜属图片
（瓜属）初生根矮化、生长受阻、有足够的次生根、属于正常幼苗。
（瓜属）初生根生长受阻、无足够的次生根。
（瓜属）初生根生长受阻、有足够的次生根。
瓜属图片
（瓜属）下胚轴短而厚。
瓜属图片
（瓜属）子叶腐烂。
胡萝卜图片
（胡萝卜）初生根受抑制。
．
（胡萝卜）初生根腐烂。
胡萝卜图片
（胡萝卜）下胚轴短而厚。
（胡萝卜）下胚轴腐烂。
胡萝卜图片
（胡萝卜）幼苗腐烂。
棉属图片
（棉属）初生根矮化。
（棉属）初生根受抑制。
．
（棉属）初生根加在种皮内。
（棉属）初生根霉烂。
棉属图片
（棉属）子叶部分枯斑。
牧草图片
（牧草）初生根缺失。
牧草图片
（牧草）胚芽鞘畸形。
（牧草）胚芽鞘畸形。
向日葵属图片
（向日葵属）初生根矮化。
（向日葵属）初生根受抑制。
（向日葵属）初生根缺失、次生根不正常。
．
（向日葵属）下胚轴初生根腐烂。
向日葵属图片
（向日葵属）下胚轴有深度裂纹。
（向日葵属）下胚轴收缩。
．
（向日葵属）下胚轴形成螺旋形。
（向日葵属）下胚轴初生根腐烂。
大麦属图片
（大麦属）胚芽鞘扭曲。
．
（大麦属）胚芽鞘开裂超过1/3。
（大麦属）胚芽鞘开裂超过1/3。
大麦属图片
（大麦属）幼苗黄色或白色。
莴苣属图片
（莴苣属）下胚轴短而厚。
（莴苣属）下胚轴短子叶增厚及卷曲。
（莴苣属）下胚轴短子叶坏死。
．
（莴苣属）下胚轴向下弯曲。
（莴苣属）下胚轴形成螺旋形。
莴苣属图片
（莴苣属）下胚轴短子叶增厚及卷曲。
．
（莴苣属）下胚轴短子叶坏死。
（莴苣属）子叶增厚及卷曲。
（莴苣属）子叶增厚及卷曲、无色。
．
（莴苣属）子叶畸形。
（莴苣属）子叶无色。
番茄属图片
（番茄属）初生根矮化。
（番茄属）初生根矮化、有次生根。
（番茄属）初生根受抑制。
番茄属图片
（番茄属）幼苗折断。
稻属图片
（稻属）幼苗发育。
（稻属）幼苗霉烂。
（稻属）幼苗霉烂。
稻属图片
（稻属）初生根缺失。
（稻属）初生根缺失。
（稻属）初生根缺失、胚芽鞘畸形。
稻属图片
（稻属）胚芽霉烂。
菜豆属图片
（菜豆属）下胚轴短。
（菜豆属）下胚轴从右侧纵向裂开。
．
（菜豆属）下胚轴缺失。
（菜豆属）下胚轴弯曲。
菜豆属图片
（菜豆属）子叶断裂无色。
．
（菜豆属）子叶枯斑。
菜豆属图片
（菜豆属）初生叶畸形缺失。
（菜豆属）初生叶缺失。
菜豆属图片
（菜豆属）顶芽受损。
（菜豆属）顶芽畸形。
（菜豆属）顶芽缺失。
．
（菜豆属）顶芽缺失。
菜豆属图片
（菜豆属）幼苗黄色。
（菜豆属）幼苗黄色。
萝卜属图片
（萝卜属）初生根矮化次生根不正常。
（萝卜属）初生根夹在种皮内。
（萝卜属）初生根矮化下胚轴短。
萝卜属图片
（萝卜属）初生根矮化下胚轴短。
（萝卜属）下胚轴向下弯曲。
萝卜属图片
（萝卜属）子叶主要部位无色。
高粱属图片
（高粱属）初生根缺失。
（高粱属）初生根缺失。
高粱属图片
（高粱属）幼苗腐烂。
高粱属图片
（高粱属）胚芽鞘畸形。
车轴草属图片
（车轴草属）初生根矮化。
小麦属图片
（小麦属）种子根短而粗、胚芽鞘畸形。
（小麦属）只有一条种子根或无种子根。
小麦属图片。