动物细胞制药ppt课件

② 细胞的特性： 形态、生长特性—增倍时间、分种批； 种源的特性：核型、同功酶、细胞抗原、特异的标记染色体；用 于生产用的重组细胞：载体构建的资料、基因拷贝数、表达产物 的性质、产量及其稳定性。
③ 各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体、各种 病毒，包括反转录病毒。
④ MWCB细胞还需确定其最高使用的传代数。
杆状病毒作为载体的优点：
①是双DNA，易于重组；
②插入7-8个bp的DNA不会影响正常病毒粒子的形成；
③多角体蛋白质和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多 角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；
④多角体蛋白基因有强启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20-30%；
⑤用显微镜可以看到多角体，可以此为标记物来挑选阳性克隆；
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第三节 动物细胞的培养条件和培养基
一、动物细胞的培养条件
1、器材的清洗和消毒 （1）器材的清洗：用过的器材需要经过浸泡、刷洗、泡
酸、冲洗4个步骤。用3%磷酸三钠日夜浸泡过夜。新玻璃器材 必须先泡酸。
（2）器材的消毒灭菌：所有培养用的器材和液体必须进 行严格的消毒灭菌处理，方法有：物理消毒---紫外线、干热、 湿热、过滤；化学法---化学消毒剂和抗生素。
6、蛋白质的合成途径和修ppt课件饰完整功能与细菌不同。
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第二节 生产用动物细胞的获得
一、生产用动物细胞的获得
什么样的细胞才能允许用以生产人用的药品，这一直 是一个引起人们争论的热点。
用于生产的动物细胞有：原代细胞、已建立的二倍体 细胞系、可无限期传代的转化细胞系、以及用这些细胞进行 融合和重组的工程细胞。
种属不同而不同。
2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。细
胞生长需要于基质上贴附，伸展后才能生长繁殖。
3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。随着年龄增大
而细胞的培养代数会减少。
4、对周围的环境十分敏感。
5、对培养基的要求高：需要12种必需氨基酸、8种以
上的维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖、多种
细胞生长因子、贴壁因子等才能生长。
（1）原始细胞库（master cell bank,MCB）；
（2）生产用细胞库（manufacturer’s working cell bank ,MWCB）或叫工作细胞库（working cell bank ,WCB）。
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贮藏细胞的档案资料：
① 细胞系历史：来源、动物的年龄、性别、细胞分离方法、 所用培养材料（来源于人的还需该人的病史）
染色体的断裂变成了异倍体，而失去了正常细胞的特点，获 得了无限增殖的能力。
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二、基因工程细胞的构建和筛选
1、真核细胞基因表达载体的构建 目前一般选择的载体有：
（1）病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒等。
牛痘病毒：构建多价疫苗；
腺病毒、反转录病毒：用于基因治疗；
杆状病毒：作载体用于外源基因表达。
② 对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化 ③ 在多数情况下要利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数， 从而获得能高效表达的稳定的工程细胞株。
三、常用生产用动物细胞的特性（自学）
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四、细胞库的建立
除原代细胞外，其他的细胞株、细胞系，无论是二倍体 细胞、转化细胞、融合细胞还是经重组的工程细胞，一旦建立 后都要建立细胞库加以保存。按照我国和美国FDA的规定，用 于生产的工程细胞必须建立2个细胞库：
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⑥如果用家蚕杆状病毒，可以在家蚕体内直接表达外源基因。
（2）质粒载体 常用穿梭质粒载体：能在细菌和哺乳动物细胞内都能扩增。
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
细胞融合染法
脂质体介导法
化学法
DNA-磷酸钙沉淀 法
DEAE-葡聚糖法
物理法
电穿孔法
显微注射法
原生质融合法
染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法 鬼影红细胞介导法
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病毒法
重组反转录病毒 介导法
重组DNA病毒 介导法
多瘤病毒样颗粒 介导法
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高效表达工程细胞株的筛选： ① 依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统：HAT选
择系统：筛选tk+、hgprt+的转化细胞；G418（geneticin）选择系 统：筛选neor的转化细胞；MTX选择系统：筛选dhfr+的转化细胞。
第六章 动物细胞工程制药
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第一节 动物细胞的形态与生理特点
一、动物细胞的形态
通常将离体培养的细胞分为贴壁细胞、悬浮细胞、
兼性贴壁细胞。
1、贴壁细胞：细胞的生长必须有给以贴附的支持物表
面，细 胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因
子才能在该表面生长、增殖。当细胞在该表面生长后，
一般形成两种形态：成纤维样细胞型、上皮样细胞型。
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2、水质
由于动物细胞对微量的有毒元素、过多的金属离子、微生
物的污染很敏感。所以细胞培养用的水必须经过特殊处理，才
能使用。方法有：蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤
维过滤。
3、pH
最适pH7.2—7.4，常在培养基中加入缓冲系统：
Na2HPO4/NaH2PO4，NaHCO3/CO2，Tricine-glycine等。
1、原代细胞：直接取动物组织、器官，经过粉碎、消 化而获得的细胞悬液。
2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆， 而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征 的细胞株。
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二倍体细胞株仍具有正常细胞的特点： A、2n染色体核型 B、具有明显的贴壁依赖和接触抑制 C、只有有限的增殖能力、一般可连续传代培养50代。 D、无致瘤性 3、转化细胞系：是通过某个转化过程形成的，常常由于
2、悬浮细胞：细胞的生长不依赖于支持物表面，可在
培养液中呈悬浮状态生长。如血液中的淋巴细胞。
3、兼性贴壁细胞：有些细胞的生长不严格地以来于支
持物，它既可以贴附于支持物表面上Fra Baidu bibliotek长，也可以在
培养基中呈悬浮状态良好地生长。
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二、动物细胞细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期长：一般需要12-48h，随不同的
4、渗透压
理想渗透压为290-300mOsm/kg，一般用NaCl的增减来调节。
每增加或减少1mg/ml，可使培养基的渗透压增加或减少
32mOsm/kg。