常用微生物染色法

1革兰染色法：

2.1.1染色剂的配制

1.1.1结晶紫液

称取结晶紫2.0g，加95%乙醇20ml，使溶解为甲液，另取草酸铵0.8g，加水80ml，使溶解为乙液。甲、乙液相混，静置48小时后使用。贮存在密闭的棕色瓶中。有效期为3个月。

1.1.2碘液

称取碘化钾2.0g，加水3~5ml，使溶解，再投入碘1.0g，用力振摇，使之全部溶解，加水稀释至300ml，即得，贮存在棕色瓶中。密闭保存，有效期为1个月。

1.1.3脱色液：95%乙醇。

1.1.4复染液：

a.沙黄（番红）复染液：称取沙黄0.25g，加95%乙醇10ml溶解，然后再加纯化水至

100ml即得。

b.稀石碳酸复红染液：称取碱性复红2.5g，研细，加95%乙醇25ml。放置过夜，用滤

纸过滤，加5%石碳酸水溶液20ml混合，为石碳酸复红液，再取此液10ml，加水

90ml，即成稀石碳酸复红液。

1.2染色操作方法：

1.2.1涂片、干燥

在载玻片上，滴一滴无菌水或生理盐水，用接种环挑少许菌苔在水涂成一薄层；或将长菌的培养液取少许轻轻涂在载玻片上，自然干燥，也可以在微火焰上通过几次，使菌体固定。

1.2.2染色步骤

a滴加结晶紫液，覆盖约1分钟，水洗，（勿使水直接冲洗涂片处）。

b滴加碘液，覆盖约1分钟，水洗、吸干。

C用95%的乙醇褪色至脱色乙醇不呈紫色为止，约20~30秒，水洗吸干。

D滴加沙黄染液或稀石碳酸复红染1分钟，水洗吸干。

1.2.3染色结果

革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。

1.3注意事项

1.3.1涂片必须洁净无油，以免影响涂片质量。

1.3.2涂片的菌量不可太浓厚，否则看不清单个菌落形态。易出现假阳性。

1.3.3用火焰固定时，不可过热，以载玻璃片不烫手为宜。

1.3.4一般以检查培养18—24小时的菌为宜，革兰氏阴性菌染色反应较稳定，不受菌龄的影响。革兰氏阳性菌易受菌龄影响，较老的细胞如培养24—48小时以上，则有部分或全部细胞转成阴性反应，所以培养18—24小时染色镜检为宜。

2芽孢染色

2.1染色液的配制

2.1.1石碳酸复红液

称取碱性复红1.0g，研细，加95%乙醇25ml。再取此溶液10ml与5%石碳酸溶液90ml。混匀，即得。

2.1.2碱性美兰液：美兰1.0g，溶于95%乙醇50ml中，再取此液30ml与0.01%氢氧化钾溶液100ml混匀即成。

2.2染色方法

2.2.1取待检菌芽孢较多的培养物，涂片，干燥及加热固定后，滴满石碳酸复红液于涂片上，

并以弱火加热，使染液冒蒸汽约5分钟，冷后水洗，并用95%乙醇脱色2分钟，加碱性美兰液半分钟，水洗，干后镜检。

2.2.2染色结果：芽孢呈红色，菌体为兰色。