光学显微重建技术与超分辨率显微镜

光学显微重建技术与超分辨率显微镜

一．光学显微重建技术

光学显微镜技术受限于光的波长，而电子显微镜虽然可以达到纳米级的分辨率，但通电的结果容易造成样品的破坏，因此能观测的样本也相当有限。这几年超高分辨率荧光显微镜跨越了一大步，使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展，从而宣告200―750纳米大小范围的模糊团块的时代结束了。

这些超高分辨率荧光显微镜技术有些基于图像照明，比如受激发射减损(stimulated emission depletion ,STED)以及相关的RESOLFT显微技术，还有饱和结构光照明显微(Saturated Structured Illumination Microscopy)，有些基于单分子开关和定位，比如随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)，以及(荧光)光敏定位显微技术(PALM, photoactivated localization microscopy)，利用这些方法可以达到生物样品成像10-100nm的分辨率，从而令研究人员观察到亚细胞结构的具体细节。

但是由于大部分蛋白分子只有几纳米，如果要直接解析细胞中这些分子的相互作用，还需要更高的分辨率。在这篇文章中，研究人员就介绍了一种实验方法，可以将荧光基团化学转换成对荧光状态光敏感的稳定暗态(dark state)，从而再次提高超高分辨率荧光显微镜技

术的分辨率。

STORM和(F)PALM方法都能通过顺序开关和单个荧光基团定位构建探针高分辨率图谱，

这需要这些探针在暗态中准备好，并带有一部分能随时开启的开关。此前曾利用过多种光控开关和光敏荧光探针，比如一些有机染料，荧光蛋白和量子点，但是部分由于这些荧光基团无法在暗态中准备，因此限制了高分辨率成像的发展。

研究人员提供的这种实验程序方法详细介绍了荧光染料和还原剂(NaBH4)的准备方法，解决了将荧光基团化学转换成对荧光状态光敏感的稳定暗态的问题。这种方法能在原位进行，由于还原染料的吸收光谱具有强烈的蓝色转移，因此染料能有效的转换进暗态。这种方法能用于多种可见光谱荧光基团，因此将能在超高分辨率显微技术中发挥重要的作用。

二．超分辨率显微镜NIKON N-STORM简介

随机光学重建显微（STORM)技术通过探测显微标本内的各荧光团的精确定位信息重建超分辨率荧光影像。N-STORM利用NIKON的强大Ti-E倒置式显微镜应用3维高精度多通道分子定位和重建，从而实现了比传统显微镜高10倍（横向约20nm）的超高分辨率。此强大技术能够观察到纳米级分子相互作用，开启研究的全新境界。

•比传统光学显微镜高10倍的超高分辨率（横向约20nm）

N-STORM利用显微镜样本内部数以千计的离散荧光体分子，实现2D或3D高精度定位信息，展现无比壮观

的超高分辨率图像，与传统光学显微镜相比，空间分辨率可提高10倍。

•N-STORM还能提供比标准光学分辨率高10倍的纵向分辨率（约50nm)

除了侧向超高分辨率之外，N-STORM更运用专有技术，令轴向分辨率也同样提高十倍，有效提供纳米

级3D信息

•使用各种荧光探针的多色成像

通过将各种“活化”探针和“报告”探针组合在一起，实现了多色超分辨率成像。从而能够对多个蛋白质

的共定位分析和相互作用进行重要的分子级研究。