固定化酶制备及酶活力测定
各种酶固定方法
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
固定化酶制备及酶活力测定
实验三固定化酶制备及酶活力测定【实验目的】1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。
2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。
在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。
酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。
载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上(图1)。
一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。
最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。
①共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。
在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。
制备固定化酶实验报告
一、实验目的1. 了解固定化酶的概念、原理及其在生物催化领域的应用。
2. 掌握固定化酶的制备方法，提高实验操作技能。
3. 通过实验，了解固定化酶的催化活性、稳定性及重用性能。
二、实验原理固定化酶是指通过物理或化学方法将酶固定在固体载体上，使其在催化反应中保持酶活性的一种技术。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长使用寿命；2. 方便酶的回收和重复利用；3. 易于控制反应条件，提高催化效率。
固定化酶的制备方法主要有吸附法、包埋法和结合法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、酶、底物、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、烘箱、恒温水浴锅、显微镜、酶标仪等。
四、实验步骤1. 吸附法固定化酶（1）将纤维素或琼脂糖溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与纤维素或琼脂糖溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
2. 包埋法固定化酶（1）将聚丙烯酰胺溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与聚丙烯酰胺溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
3. 结合法固定化酶（1）将酶蛋白分子与不溶性固相支持物（如离子交换树脂）进行离子键结合。
（2）将结合后的酶蛋白分子与底物反应，观察催化效果。
五、实验结果与分析1. 吸附法固定化酶：通过吸附法固定化酶，酶的活性保持较好，但固定化酶的稳定性较差，易受外界环境因素影响。
2. 包埋法固定化酶：通过包埋法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，但固定化酶的催化效率较低。
3. 结合法固定化酶：通过结合法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，且催化效率较高。
六、实验结论1. 固定化酶的制备方法有吸附法、包埋法和结合法，各方法有其优缺点。
实验五 固定化脲酶活力的测定
实验五固定化脲酶活力的测定一、实验原理固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。
常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。
酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。
故可测定脲酶活力的大小。
二、仪器和试剂1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器2、实验四制备的固定化脲酶3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 ml4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶解并定容至100 ml。
此溶液含NH3为40 µM6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，冷却后加水定容至1000 ml7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。
另称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮于棕色瓶中，密塞保存。
三、实验步骤1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。
取0.3-0.5 g，切碎。
2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水浴中保温5 min。
3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。
酶固定化实验报告
一、实验目的1. 了解酶固定化的原理和方法。
2. 掌握酶固定化过程中的关键步骤。
3. 分析固定化酶的性能及其影响因素。
二、实验原理酶固定化是将酶固定在固体载体上，使其在反应过程中保持活性，便于重复使用。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长酶的使用寿命。
2. 降低酶的生产成本，提高生产效率。
3. 方便酶的分离和回收，减少环境污染。
三、实验材料1. 酶：青霉素酰化酶（PGA）2. 固定化载体：海藻酸钠、明胶、壳聚糖等3. 试剂：NaCl、CaCl2、HCl、NaOH、磷酸盐缓冲液等4. 仪器：恒温水浴、pH计、分光光度计、移液器、离心机等四、实验步骤1. 酶的活化将青霉素酰化酶溶于磷酸盐缓冲液，调节pH值为7.0，在37℃下活化30分钟。
2. 载体的准备将海藻酸钠、明胶、壳聚糖等载体分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为1%的溶液。
3. 酶的固定化将活化后的酶与载体溶液混合，搅拌混合均匀。
将混合液滴入CaCl2溶液中，使酶与载体形成凝胶珠。
4. 固定化酶的洗涤用磷酸盐缓冲液反复洗涤固定化酶凝胶珠，去除未固定的酶和杂质。
5. 固定化酶的活化将洗涤后的固定化酶凝胶珠放入磷酸盐缓冲液中，在37℃下活化30分钟。
6. 酶活性的测定采用比色法测定固定化酶的活性。
以青霉素G为底物，在37℃下反应30分钟，用紫外分光光度计测定反应液中的青霉素G浓度，计算酶活性。
7. 固定化酶的稳定性测试将固定化酶凝胶珠分别在不同温度、pH值、离子强度等条件下进行稳定性测试。
五、实验结果与分析1. 酶的固定化效果通过比色法测定，固定化酶的活性与游离酶活性相近，表明固定化过程未对酶活性产生显著影响。
2. 固定化酶的稳定性固定化酶在不同温度、pH值、离子强度等条件下均表现出良好的稳定性，表明固定化酶具有良好的耐温、耐酸碱、耐盐等性能。
3. 固定化酶的重复使用性固定化酶经过多次反应和洗涤后，仍保持较高的酶活性，表明固定化酶具有良好的重复使用性。
实验四 α-淀粉酶的固定化及其酶活测定
酶活力测定
吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液于烧杯中，加入磷酸缓冲液
5 mL，摇匀后，置于40℃±0.2℃恒温水浴中预热8 min；
加入1g固定化酶，立即计时，100r/min条件下准确反应5 min；
立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL
盐酸溶液和5. 00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL 盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用 10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1， 求得测试酶液的浓度。
三、仪器和试剂
仪器：
电子天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、玻棒、 量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针 头）、纱布等。 试剂：
海藻酸钠、无水氯化钙、无水磷酸氢二钠、氯 化钠、苯甲酸、可溶性淀粉、碘酸钾、碘化钾、 浓盐酸。
四、实验方法
配A液：
取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中， 沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自 然冷却。
作中Ca2+的作用有何区别？
酶的固定化方法
海藻酸钙凝胶包埋法
称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓 度的海藻酸钠溶液一定浓度的氯 化钙溶液中，形成球状固定化酶胶粒。
海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化酶的操作简便， 条件温和，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝 胶的孔径，还适合于多种细胞的固定化。
五、酶活力计算
中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X1 = c× n 式中: X1—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入 固定化酶的量来控制） 。 所得结果表示至整数。 允许差： 平行试验相对误差不得超过5%
六、思考题
固定酶的实验报告
一、实验目的1. 了解固定酶的概念、原理和特点；2. 掌握固定酶的制备方法；3. 探究固定酶在酶促反应中的催化活性。
二、实验原理固定酶是指将酶固定在固体载体上，使其在催化反应过程中保持稳定性和重复使用性的酶。
固定酶具有以下特点：1. 催化活性高，稳定性好；2. 可重复使用，降低成本；3. 便于分离、纯化和回收。
固定酶的制备方法主要有吸附法、交联法和包埋法等。
本实验采用吸附法固定酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白酶- 牛奶- 硅胶- 酶反应缓冲液- pH试纸- 移液器- 离心机- 酶标仪2. 实验仪器：- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 恒温水浴锅- 酶标仪四、实验步骤1. 准备固定化蛋白酶（1）将蛋白酶溶液与硅胶混合，比例为1:10；（2）搅拌均匀，使蛋白酶充分吸附在硅胶表面；（3）将混合液倒入烧杯中，加入适量的酶反应缓冲液，调节pH值至蛋白酶的最佳pH值；（4）将烧杯放入恒温水浴锅中，恒温30分钟；（5）取出烧杯，用玻璃棒搅拌，使固定化蛋白酶充分分散；（6）用离心机离心，去除未吸附的蛋白酶溶液；（7）收集固定化蛋白酶，备用。
2. 酶促反应（1）将固定化蛋白酶与牛奶混合，比例为1:10；（2）用pH试纸检测混合液的pH值，确保在蛋白酶的最佳pH值范围内；（3）将混合液放入恒温水浴锅中，恒温30分钟；（4）取出混合液，用酶标仪检测酶促反应的活性。
五、实验结果与分析1. 固定化蛋白酶的制备通过吸附法固定蛋白酶，成功制备了固定化蛋白酶。
固定化蛋白酶在离心后，与未吸附的蛋白酶溶液分离，说明固定化效果良好。
2. 酶促反应活性在酶促反应中，固定化蛋白酶对牛奶中的蛋白质具有催化分解作用。
通过酶标仪检测，固定化蛋白酶的酶促反应活性较高，表明固定化酶具有良好的催化效果。
六、实验结论1. 固定酶是一种具有催化活性高、稳定性好、可重复使用等特点的酶；2. 吸附法是一种有效的固定酶制备方法；3. 固定酶在酶促反应中具有较好的催化效果。
固定化酶制备及酶活力测定
馏水，充分摇匀。 （4） 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm 处测定光密度。 （5） 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
表1-1 不同含量酪氨酸溶液的配制
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量 （μg） 0 100 200 300 400 500 600
1 克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1 微克酪氨酸， 定为一个酶活力单位（U）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位= m / t × f M：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）； t：酶促反应的时间（15 min）； f：酶的稀释倍数，本实验中f =1000
协同致远 创新至尖 绿色发展 和谐制药
固定化酶制备及酶活力测定
实验者：张伟达 绿色制药1402班 201430360226 同组者：张朝焕、张颖琼 实验日期：2016年5月30日 报告完成日期：2016年6月1日 指导老师：易 喻
酶制剂的制备
酶制剂的制备全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：酶制剂是一种应用于生物工程领域的重要生物催化剂，广泛应用于食品、医药、农业等领域。
酶制剂的制备主要通过菌种培养、酶提取和纯化、酶活力测定等步骤完成。
本文将详细介绍酶制剂的制备的各个环节及其相关技术。
一、菌种培养1. 选择菌株：酶制剂的制备首先要选择适合生产目标酶的菌株。
常见的菌种有大肠杆菌、酵母菌、真菌等。
2. 培养条件：菌种培养需要控制适当的温度、PH值、营养液成分等条件。
常用的培养基有LB培养基、YP培养基等。
3. 菌种培养：将选定的菌株接种到含有适当培养基的培养皿中，进行静态或摇床培养，通过控制时间和条件，使菌株在培养基中生长繁殖。
二、酶提取和纯化1. 酶提取：将培养好的菌株经过离心、过滤等方法将酶提取出来。
不同的酶可采用不同的提取方法，如超声波法、冻融法、离心法等。
2. 酶纯化：提取出的酶一般含有其他杂质，需要经过一系列纯化步骤进行纯化。
纯化的方法包括离子交换层析、凝胶渗透层析等。
三、酶活力测定1. 酶活力测定：通过测定酶的活性来评估酶的品质。
常用的测定方法有比色法、荧光法、密度法等。
2. 酶活性稳定性：除了测定酶的活性，还需要考虑酶的活性稳定性，即在不同温度、PH值下酶的活性是否保持稳定。
四、酶制剂配方设计1. 酶活性强化：根据不同的应用需求，可以对酶进行改良，提高其催化性能和特异性。
2. 辅酶添加：在制备酶制剂的过程中，有时需要添加一些辅酶或辅因子来增强酶的活性。
五、酶制剂的应用1. 食品工业：酶制剂广泛应用于食品加工领域，如发酵剂、酶改良剂等。
2. 医药工业：酶制剂可用于药物合成、酶促反应等，对于特定靶标的酶抑制具有重要意义。
3. 农业领域：酶制剂在农业生产中起着促进土壤改良、提高作物产量等作用。
酶制剂的制备是一个涉及多学科知识的复杂工程，需要科研人员在菌种培养、酶提取和纯化、酶活力测定等方面进行深入研究，以提高酶制剂的生产效率和品质。
固定化-淀粉酶及活性测定要点
固定化-淀粉酶及活性测定要点实验六固定化α-淀粉酶及活性测定一、实验目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术二、实验原理：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。
交联剂为戊二醛，载体为甲壳素。
三、实验器材：1．恒温水浴锅2．恒温振摇仪四、实验试剂1. 5%戊二醛2. 甲壳素3. 碘原液：称取碘1.1g。
碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml 蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。
再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。
摇均后放于棕色试管中备用。
4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。
5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。
然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。
6. pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。
7. 标准终点色溶液，A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸钾（K2GrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。
混合液在15天内使用有效。
五、实验操作1. 酶液的制备：精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。
将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。
最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。
固定化实验报告
实验名称：固定化酶实验实验目的：1. 了解固定化酶技术的原理和应用。
2. 学习固定化酶的制备方法。
3. 探究固定化酶的稳定性及其催化活性。
实验时间：2023年3月15日实验地点：生物实验室实验器材：1. 酶制剂2. 底物3. 固定化载体（海藻酸钠）4. 离心机5. 烧杯6. 移液器7. pH计8. 烧瓶9. 恒温水浴锅10. 紫外分光光度计实验步骤：1. 准备固定化酶载体：将海藻酸钠溶解于适量的蒸馏水中，配制成一定浓度的溶液，加入少量CaCl2，搅拌均匀，使其凝固。
2. 制备固定化酶：将酶制剂与底物按照一定比例混合，加入固定化载体溶液，搅拌均匀，使酶与载体充分结合。
3. 固定化酶的制备：将混合液倒入烧杯中，放入恒温水浴锅中，恒温加热，使酶与载体进一步结合，形成固定化酶。
4. 固定化酶的离心分离：将固定化酶溶液放入离心机中，离心分离，收集固定化酶。
5. 固定化酶的稳定性实验：将固定化酶分别在不同温度、pH值、底物浓度等条件下进行反应，观察固定化酶的稳定性。
6. 固定化酶的催化活性实验：将固定化酶与底物按照一定比例混合，放入烧瓶中，进行反应，通过紫外分光光度计检测反应液中的产物浓度，计算固定化酶的催化活性。
实验结果：1. 固定化酶的制备：成功制备了固定化酶，酶与载体结合良好，固定化酶具有良好的稳定性。
2. 固定化酶的稳定性实验：- 在不同温度下，固定化酶的稳定性较好，40℃时催化活性最高。
- 在不同pH值下，固定化酶的稳定性较好，pH值为7时催化活性最高。
- 在不同底物浓度下，固定化酶的稳定性较好，底物浓度为0.1mol/L时催化活性最高。
3. 固定化酶的催化活性实验：- 通过紫外分光光度计检测反应液中的产物浓度，计算固定化酶的催化活性，结果表明固定化酶具有较好的催化活性。
实验结论：1. 固定化酶技术是一种有效提高酶稳定性和催化活性的方法。
2. 通过固定化酶技术，可以降低酶的失活率，延长酶的使用寿命。
酶的固定化..
纤维素
CMC －CH2COOH
+盐酸甲醇
CMC－甲酯 ＋肼 制备酰肼 CMC－酰肼 亚硫酸钠 ＋ 盐酸 CMC－叠氮化物 ＋NH2 酶
重氮化剂、烷化
剂等反应形成共 价键制备固定化
酶。
叠氮化物
固定化酶 －CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
共价键结合法
4.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。 载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等 包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法。 凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微
孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多 数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶 有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶 以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球
内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰 胺膜、火棉胶膜等。
包埋法
凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰 胺
氢气
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N， N－ 双丙烯 酰胺
测固定化酶活的实验报告
一、实验目的1. 掌握固定化酶活性测定的原理和方法。
2. 了解固定化酶的制备过程及其影响因素。
3. 评价固定化酶的催化性能。
二、实验原理固定化酶是将酶固定在固体载体上，使其在催化反应过程中保持活性，并能反复使用。
固定化酶的活性测定是评价其催化性能的重要指标。
本实验采用比色法测定固定化酶活性，通过比较固定化酶和游离酶的催化效果，了解固定化酶的催化性能。
三、实验材料与仪器1. 材料：纤维素酶、海藻酸钠、葡萄糖标准溶液、DNS试剂、蒸馏水、氢氧化钠、硫酸、氯化钠等。
2. 仪器：电子天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、玻棒、量筒、试管、移液管、滴定管、锥形瓶等。
四、实验步骤1. 固定化酶的制备（1）配制海藻酸钠溶液：称取1.5g海藻酸钠，加入100ml蒸馏水，煮沸溶解，冷却至室温。
（2）固定化酶制备：将2.5ml纤维素酶液与10ml海藻酸钠溶液混合均匀，倒入氯化钙溶液中，形成凝胶珠，用滤纸吸去多余水分。
2. 固定化酶活性测定（1）配制反应体系：取5ml蒸馏水、5ml底物溶液、5μl DNS试剂，加入锥形瓶中。
（2）加入酶液：将制备好的固定化酶用蒸馏水洗涤，加入反应体系中，置于50℃水浴中反应30min。
（3）终止反应：加入2ml硫酸终止反应。
（4）显色：加入5ml氢氧化钠溶液，置于沸水浴中显色15min。
（5）测定吸光度：用分光光度计在540nm波长下测定吸光度。
3. 数据处理（1）计算固定化酶活性：固定化酶活性 = 游离酶活性× 固定化酶与游离酶的质量比。
（2）绘制固定化酶活性曲线：以固定化酶用量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制固定化酶活性曲线。
五、实验结果与分析1. 固定化酶制备过程中，凝胶珠的形成与海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、固定化酶用量等因素有关。
2. 固定化酶活性随固定化酶用量的增加而增加，但存在一个最佳用量。
3. 固定化酶活性曲线呈上升趋势，表明固定化酶具有良好的催化性能。
4. 固定化酶活性比游离酶活性低，但差距不大，说明固定化酶在催化过程中仍保持较高的活性。
果胶酶的固定化及其活力测定
正文果胶酶的固定化及其活力测定一、目的：果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。
在果品加工业中，果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。
果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。
果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大提高了产品生产成本。
固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。
通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。
二、原理：本实验固定化方法为共价结合法。
以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。
壳聚糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。
三、试剂及仪器仪器：冷冻离心机分光光光度计比色皿（8只）摇床水浴箱混合振荡器天平瓷盘药匙剪刀(1把) 记号笔（1支）通风橱吸水纸具塞刻度试管（4支）三角瓶（2支）烧杯（100ml×3个）试管架（1个）试管（6支）量筒（100ml×1个）滴管（16个）离心管(5ml×2个,50ml×1个)移液管架(1个) 移液管(2ml×3个,5ml×1个) 注射器（1支）滴管(1个)吸耳球（1个）洗瓶（1个）玻棒（1个）烧杯(300 ml×5个)试剂：乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0）磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5－二硝基水杨酸氢氧化钠冰醋酸丙三醇戊二醛无水乙醇浓盐酸果胶酶果胶半乳糖醛酸壳聚糖蒸馏水若干桶四、方法步骤1 载体的制备1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。
实验-6固定化酶
二、基础知识
2、固定方法:吸附法、共价偶联法、交 联法和包埋法等。 将固定化酶装柱后，在酶的作用下 转变为产物。使用固定化酶技术，反 应柱能连续使用半年，降低了生产成 本，提高了产量和质量。
1、酶 2、将酶吸附在载体表面上 3、将酶相互共价连接 4、将酶包埋在细微网格里
酶的几种固定方式示意图
三、实验设计
1号
2号
3号
1号孔为流出液:颜色呈棕红色，说明淀粉溶液经 固定化酶催化后可使淀粉水解成糊精。 2号孔为淀粉液:颜色呈蓝色，说明里面含有淀粉。 3号孔为碘液:棕黄色。
（5）用水稀释淀粉滤液1倍后 再观察颜色并填写下表。
（6）实验后，用10倍柱体积的蒸 馏水洗涤此柱，放置在4℃冰箱中， 几天后再重复上述实验，看是否 有相同的结果。
（3）将灌注了固定化酶的注射器 放在支架上，用滴管加1%淀粉溶 液，使淀粉溶液约以0.3ml/min的 流速过柱。
（4）在流出5mL反应液后接收约 0.5mL流出液，加入1-2滴KI-I2溶 液，观察颜色。
1、取5mg石英砂，加入4 mLα-淀粉酶，缓慢搅拌使 α-淀粉酶固定到石英沙上
石英砂
α-淀粉酶
2211取取55mgmg石英砂石英砂加入加入44mlml淀粉酶淀粉酶缓慢搅拌使缓慢搅拌使淀粉酶固定到石英沙上淀粉酶固定到石英沙上淀粉酶石英砂2用蒸馏水清洗石英砂几次12次如下面左图最后一次清洗时取上清液2滴加到点样板上同时加入1淀粉溶液混合再加入kii溶液检测未固定到石英砂上的淀粉酶是否已经全除去如下面右图
2、实验目的： （1）制备固定化ɑ-淀粉酶； （2）进行淀粉水解酶的测定。
3、实验仪器及用具： 层析柱（一次性针管注射器）, 锥形瓶， 玻璃棒，电子天平，50mL烧杯，250mL烧杯， 支架, 移液枪或吸管 ,点样板,玻璃棒;
实验三 固定化活性干酵母细胞的制备及活力测定
一、试剂 (1)3.0％海藻酸钠 (2)0.2mol／L 氯化钙溶液 (3)市售干酵母粉 (4)3,5—二硝基水杨酸(DNS)试剂：取 6.3g 3,5—二硝基水杨酸(DNS)和 262mL 2mol／LNaOH 溶液加到酒 石酸钾钠的热溶液中(192g 酒石酸钾钠溶于 500mL 水中)，再加 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌使其溶解， 冷却后加水定容至 1000mL，保存于棕色瓶中。 (5)pH4.6、0.2mol／L 醋酸缓冲液 (6)1.5mol／L 蔗糖溶液(用 pH4.6、0.2mol／L 的醋酸缓冲液溶解蔗糖) 二、仪器 (1)漏斗 (2)烧杯 (3)带针头的注射器 (4)磁力搅拌器 (5)移液枪 (6)试管 (15 支) (7)抽滤装置 (8)烧杯 150mL(2 个) (9)电动磁力搅拌器 (10)分光光度计 (11)电热恒温水浴锅 (12)温度计 1 支
操作步骤
一、菌体悬浮液的制备 称取含转化酶活力的市售活性干酵母粉 15g，用 5mL、pH4.6 的醋酸缓冲液将酵母粉制成均匀浆液，
备用。 二、菌体的固定化
本实验选用通透性好，包埋量大，易再生的海藻酸钠作为包埋载体。称取 1.0g 海藻酸钠，缓慢加入 到 50mL 的热蒸馏水中，使之完全溶解。将制备好的酵母细胞悬液与溶解完全海藻酸钠凝胶充分混合(要 求在无菌条件下)搅拌均匀。用注射器吸取上述混合浆液，再用注射针头逐渐地滴人到 0.2mol/L 氯化钙 溶液中，在其搅拌的条件下制成直径约 2-3 mm 的球状凝胶颗粒。制粒完毕后，于该溶液中再固化 20-30min。
实验三 固定化活性干母细胞的制备及活力测定
实验目的
1．学习固定化微生物细胞的制备方法 2．通过该方法的学习，了解其他固定化方法及实践意义 3．掌握固定化生物催化剂活力测定方法 4．学会利用固定化活性干酵母凝胶生产转化糖
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
+
+ H+
+
-
OH-
-
-
OH-
-
OH- -
-OH-
-
-
-
-
5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
实验三酶的固定化
•
•
• 二、实验材料、仪器与试剂
• （一）实验材料与仪器
• 干燥箱；电子天平；注射器；碘量瓶；磁力搅拌器；pH 计；恒温水浴锅等。
• （二）主要试剂
• 糖化酶；3%海藻酸钠溶液；2%氯化钙溶液。 2％可溶性 淀粉液； pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液； 0.1mol／L碘 液； 0.1mol／L氢氧化钠溶液； 1mol／L硫酸溶液； 0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液； 0.5％淀粉指示剂。
• 四、实验数据基本要求 （一）酶活力计算
在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位。
（二）固定化酶活力回收率计算
固定化酶总活力 活力回收率= 游离酶总活力
（三）固定化酶比活力计算
•
三、实验内容
• （一）固定化酶的制备
• 1、将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温。 • 2、取糖化酶2g，悬浮在10ml海藻酸钠溶液中混合均匀。 • 3、用注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50 ml氯化钙溶液中，浸泡20 min 左右。 • 4、滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次，除去凝胶珠表面的酶，得到固定化酶。置 于4℃冰箱中冷藏备用。
• 实验三
酶的固定化
• 一、实验基本原理 • 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙பைடு நூலகம்液。 形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中，制成 固定化酶。 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）活性测定原理：在一定条 件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂 次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减 少量计算葡萄糖的量，从而计算算酶活力。
• （二）糖化酶活力测定
• 1、吸取2%可溶性淀粉10ml，加入pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液5ml，混匀后 于40℃水浴预热10min。 • 2、加入酶液1ml（空白实验以煮沸失活的酶液代替正常酶液），于40℃，反 应10min。反应结束时，于沸水浴中煮10min，以终止反应。 • 3、吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol／L碘液及0.1mol／L氢氧化 钠溶液各5ml，摇匀，于室温下在暗处放置15min，加入2ml硫酸酸化。 • 4、以0.5％可溶性淀粉为指示剂，用0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色 消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数（A），以及空白实验消耗的 硫代硫酸钠溶液毫升数（B）。
固定化酶实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解固定化酶的基本原理和操作方法。
2. 掌握固定化酶的性能评价方法。
3. 通过实验，验证固定化酶的稳定性、重复使用性和催化活性。
二、实验原理固定化酶是将酶固定在固体载体上，使其既具有酶的催化活性，又便于回收和重复使用。
固定化酶技术广泛应用于生物催化、生物传感器、生物制药等领域。
本实验采用吸附法固定化脂肪酶，通过改变吸附条件，优化固定化效果。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 脂肪酶- 牛奶- 碳酸钙- 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）- 0.05 mol/L柠檬酸缓冲溶液（pH 5.0）- 0.05 mol/L盐酸缓冲溶液（pH 2.0）- 0.1 mol/L NaOH溶液- 0.1 mol/L HCl溶液- 碘液- 水浴锅- 移液器- 离心机- 分光光度计2. 实验仪器：- 烧杯- 试管- 移液管- 移液器- 离心机- 恒温水浴锅- 分光光度计四、实验方法与步骤1. 固定化酶的制备a. 准备脂肪酶溶液：取适量脂肪酶，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）溶解，配制成一定浓度的脂肪酶溶液。
b. 准备载体：将碳酸钙用0.1 mol/L NaOH溶液处理，使其表面活化。
c. 吸附固定：将活化后的碳酸钙与脂肪酶溶液混合，在室温下搅拌吸附2小时。
d. 洗脱：用0.1 mol/L HCl溶液将固定化酶洗脱，收集洗脱液。
2. 固定化酶性能评价a. 稳定性：将固定化酶在4℃下保存，每隔一定时间测定其酶活性，观察酶活性的变化。
b. 重复使用性：将固定化酶连续使用，每次使用后测定其酶活性，观察酶活性的变化。
c. 催化活性：将固定化酶与底物混合，在适宜条件下反应，测定反应产物的浓度，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 固定化酶的稳定性实验结果显示，固定化酶在4℃下保存，酶活性逐渐下降，但在一定时间内仍保持较高的酶活性。
2. 固定化酶的重复使用性实验结果显示，固定化酶连续使用5次后，酶活性仍保持在较高水平。
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1mg/mL 酪氨酸 标准溶液（mL）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
蒸馏水 （mL）
2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4
1.2.2.2 固定化酶活力测定 上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的 三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15 min后，取3 mL置于试管中，加3 mL，三氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1% 酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液 1mL，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴保温5min， 然后每管各加入3 mL 蒸馏水，摇匀。用721 型分光光度计在波长680 nm处，以对照管为
0.7
0.6
y = 0.0009 x + 0.0166
R² = 0.9941
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
100
200
300
400
500
600
700
根据表格数据用计算机拟合得到OD值与酪氨酸含量的标准曲线为y = 0.0009 x + 0.0166
2.1.1 酪氨酸标准曲线的绘制
本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：
1
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1. 实验过程
1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂 ①海藻酸钠，0.3%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0 mg/mL） ③福林试剂 ④1%酪蛋白溶液 ⑤ pH 10 缓冲液 ⑥标准酪氨酸溶液 ⑦0.4mol/L 碳酸钠溶液，0.4molห้องสมุดไป่ตู้L 三氯醋酸溶液 1.1.2 仪器
馏水，充分摇匀。 （4） 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm 处测定光密度。 （5） 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
表1-1 不同含量酪氨酸溶液的配制
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量 （μg） 0 100 200 300 400 500 600
1 克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1 微克酪氨酸， 定为一个酶活力单位（U）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位= m / t × f M：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）； t：酶促反应的时间（15 min）； f：酶的稀释倍数，本实验中f =1000
实验结果表明：固定化酶能够增强酶的稳定性，便于酶和底物的分离，但多次使用可 能会降低酶活力，但具体情况还有待更多相关实验的测定。本组固定化酶的酶活力大约是 游离酶活力的60%，说明固定化酶的活力明显低于游离酶的活力，这也印证了酶固定化过 程中有部分酶损失或者包埋不彻底，以及部分处理操作方法影响了酶的活性甚至使部分酶 失活。在实际生产中，固定化酶虽然活性不及游离酶，但是却有着游离酶不可比拟的优 势，因此我们要找到酶活与量的平衡点，找到一个最经济却最实用的量。
【前 言】酶的固定化是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通 常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使 之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶活力指酶催化某些反应的能力。酶活力可用 一定条件下它催化的某一化学反应的反应速度来表示。为了灵敏起见，通常测定单位时间内 产物的生成量。由于酶促反应速度随时间推移而降低，为正确测得其活力，必须测定反应的 初速度。碱性蛋白酶在碱性条件下可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的 氨基酸，可以福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。利用比色法测定酪氨 酸的量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
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固定化酶制备及酶活力测定
实验者：张伟达 绿色制药1402班 201430360226 同组者：张朝焕、张颖琼 实验日期：2016年5月30日 报告完成日期：2016年6月1日 指导老师：易 喻
【摘 要】酶的固定化技术是用物理或化学方法处理水溶性酶使之成为不溶于水或溶于固定 相载体后仍具有活性的酶的衍生物，固定化酶不但具有一般酶的特性，而且还可以长期重复 使用，具有较高的经济效益。本实验采用包埋法进行酶的固定化，并使用福林酚法测定碱性 蛋白酶的酶活力（即酶所催化的化学反应的速度）。根据实践可知：包埋法固定化酶条件相 对温和，能够重复使用，但方法本身会一定程度上造成酶的活力的降低。
①磁力搅拌棒
②恒温水浴锅
③注射器 ④烧杯（100mL，500mL） ⑤布氏漏斗
⑥分析天平
⑦容量瓶
⑧移液管 ⑨721 分光光度计 1.2 操作步骤 1.2.1 酶的固定化 称取 1.00g 海藻酸钠于盛有 30mL 蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温 渐冷却至 38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液 20mL。 用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有 200mL3.0％氯化钙溶液的 烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化 30min，倾去氯化钙溶液， 用适量蒸馏水洗涤 2~3 次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。 1.2.2 酶活力的测定 1.2.1.1 制备酪氨酸标准曲线 （1） 取7 支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表） （2） 在上述7 支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15 min，
5
取出后，加入0.4 mol/L 三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
2
协同致远 创新至尖 绿色发展 和谐制药
（3）分别吸取滤液1mL 放入另7 支试管中，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5 mL，福林试 剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL 蒸
3. 注意事项与心得总结
3.1 注意事项 （1）酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加 入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。 （2）固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2 溶液滴加的速度不要过快， 混合物要呈颗粒进入CaCl2 溶液，以免形成念珠状颗粒。 （3）在制备酶活力测定的空白对照时要先加入三氯醋酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液， 顺序不可以颠倒。 （4）在酶活力测定是要严格控制水浴保温的时间一致，控制变量，减少实验误差。 （5）每次使用比色皿测吸光度值时要保证比色皿充分洗干净，最好在乙醇溶液中浸泡 一下。 3.2 心得体会 固定化酶拥有不可比拟的优点，具有很强的实用性和经济效益。本实验通过包埋法进 行了固定化酶的制备及固定酶与游离酶的酶活力比较，发现固定酶虽然能够增强酶的稳定 性，便于酶和底物的分离，但是会造成酶量的损失，使酶活力降低。所以需要寻求一种能 提高酶结合率的固定方法。我们在有条件时还可以尝试其他方法进行酶的固定化，比如交 联法、载体结合法等进行尝试。 致谢： 感谢队友们的合作共同进步以及易喻老师的耐心指导！
【关键词】固定化酶技术 酶 包埋法 福林酚法 酶活力 【Abstract】Technology of immobilized enzyme is physical or chemical methods were used to deal with water soluble enzyme to become insoluble in water or dissolved in stationary phase carrier still has derivatives of the activity of the enzyme, immobilized enzyme not only has general enzymatic properties, but also can be repeatedly used for a long time, has high economic benefit. In this experiment the embedding method of enzyme immobilization, and using the Folin phenol method for the determination of the enzyme activity of alkaline protease (i.e., the enzyme that catalyzes the chemical reaction speed). According to the practice, it can be known that the condition of immobilized enzyme is relatively mild, and can be used repeatedly, but the method itself will cause the enzyme activity to be reduced to a certain extent.
表2-2 固定酶与游离酶活力的测定比较表
空白 固定酶 游离酶
酶量 （mg）
1.0
1.0 1.0 1.0 1.0
OD值
0.000 0.279 0.275 0.438 0.428
酪氨酸量 （μg）
0.00
291.56 287.11 462.67 457.11
碱性蛋白酶活力单位 （U） 0.00
19437.04 19140.74 30844.44 30474.07
19288.89 30659.26
酶结合效率 （%）
62.91
2.2 实验讨论 本实验中标准曲线绘制时得到的R2>0.99，线性关系良好。部分实验误差的来源可能来
4