纸层析

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生 物 化 学 实 验
酶的特异性及影响酶活性的因素
移液管的使用方法 生 物 化 学 实 验
⑴看。查看移液管的标示的要求。 ⑵选。根据不同需要选用大小合适的移液管。 （一次 取样，就近选择）
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酶的特异性及影响酶活性的因素
生 物 化 学 实 验
移 液 管 的 使 用 方 法
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
32 32
48 16 16 16
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16 16
12
4
36
12 18 6
6.75 2.25 2.25 0.75
8
8 4 4 2 2
16
16 12 12 8 8
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析 法。层析溶剂由有机溶剂和水组成,滤纸和水的亲 和力强，与有机溶剂的亲和和弱,因此在展层时,水 是固定相,有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上 （原点）,进行展层,样品中的各种氨基酸在两相溶 剂中不断进行分配,由于它们的分配系数不同,不同 氨基酸随流动相移动速率就不同,于是将这些氨基 酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,Rf）来表示 Rf = 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶 剂前沿的距离(Y)
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酶的特异性及影响酶活性的因素
移液管的使用方法 生 物 化 学 实 验
⑴看。查看移液管的标示的要求。 ⑵选。根据不同需要选用大小合适的移液管。 （一次 取样，就近选择）
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酶的特异性及影响酶活性的因素
移 液 管 的 使 用 方 法
⑶润。吸取溶液时要把吸管用所吸溶液润洗2-3次。 ⑷ 移液。：一般用右手的大拇指和中指拿住管颈刻度线上方，把管插 入溶液中，左手拿吸耳球，把球内空气排出，把吸耳球的尖端接在管 口，慢慢松开左手，使溶液吸入管内，当液面升到刻度线上方时，移 开吸耳球，立即用右手的食指按住管口，大拇指和中指拿住管刻度线 上方，再使管离开液面，管末端仍靠在盛溶液器皿的内壁上。略松食 Exit 指，使液面平稳下降，直到溶液的弯月面与刻度标线相切。
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
注意事项
2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果 不好，样品用量大会造成“拖尾巴”现象。
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
注意事项
3. 样品在原点未移动，是因为展层剂出问题， 在展层剂中混入了平衡溶剂，因为平衡溶剂是 放置时间长了的展层剂，展层剂出现脂化现象， 使分配系数发生变化。 4.分离时间短使有些已知氨基酸的Rf值非常相 似，分析时可以辅颜色不同加以区分。
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验步骤
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1.准备层析缸，加入平衡溶液，加入展层剂。 2.准备滤纸 取层析滤纸（16㎝×12㎝）一张。在滤纸 12㎝的那条边距边缘1.5㎝处用铅笔划一条直线， 在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样点 （共4个点样点）。 3.点样(4种氨基酸） 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个 位置上。每点在纸上扩散的直径最好不超过3mm。
8
8 12 12 12 12 4 4 8 8 2 2
3
27 9
20.25 6.75 10.1 3.4 20.25 6.75 20.2 6.8 15.2 5.4
1
0.75 0.25 0.19 0.06
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验药品
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1.展层剂：正丁醇：水：冰乙酸=20：15：5 2.平衡溶液 3.样品：赖氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，未知 混合氨基酸 4.显色剂：0.1%茚三酮的正丁醇溶液
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生物化学实验
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
主讲：刘连芬 聊城生命科学学院 E-Mail：liulianfen@
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
生 物 化 学 实 验
一、实 验 原 理
二、主要实验仪器 三、实 验 步 骤 四、实 验 小 结
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下一个实验 酶的专一性及影响酶活性的因素
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⑸放液。将管插入接受器中，管尖仍靠在接受器内壁，管垂直， 并与接收器约呈15度夹角，松开食指，使管内液体自然沿壁流下， 遗留在管内的溶液若标有吹的则吹入接收器内，若未标吹的，停 留等待3秒钟，同时转动移液管。 Exit ⑹洗涤、放置。将管洗净，放在管架上 。
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验原理
只要条件（如溶剂系统、温度、湿度、层析滤 纸的型号和质量）不变，某种物质的Rf值是常数。 此时 Rf值的大小只取决于物质的结构和性质。可 根据Rf作为定性依据。 样品中如有多种氨基酸，其中有些氨基酸的Rf 值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能 将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤 纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的 目的，这种方法叫双向层析。
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氨基酸的分离鉴定——纸层析法
ห้องสมุดไป่ตู้
实验步骤
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4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能 接触。将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下， 扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升7 ～8㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线， 用吹风机吹干。 5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇 溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。在 脯氨酸的黄色斑点刚好出现时停止吹风。 6.计算：计算各种氨基酸的比移（Rf）值。
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溶剂前沿
溶剂前沿
亮 层析点 苯丙
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缬 脯
赖
原点
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注意事项
1.取滤纸前，要将手洗净，并尽可能少接触滤 纸，不得已时只能拿滤纸的一角，平放在洁净 的纸上。