酵母菌观察

酵母菌子囊孢子观察及死活细胞鉴别

摘要：以酿酒酵母（S.cerevisiae）为菌种，采用美蓝浸片法和孔雀绿-番红复染法对酿酒酵母进行染色，然后制片，进行显微观察。结果显示，酵母菌进行无性生殖（出芽生殖）和有性生殖（产生子囊孢子）；死细胞呈蓝色或淡蓝色，活细胞呈无色；菌体及子囊呈红色，子囊孢子呈绿色。

关键词：酿酒酵母；美蓝浸片；孔雀绿-番红复染；显微观察

前言：酵母菌是不运动的单核真核微生物，有有性生殖和无性生殖两种生殖方式。有性生殖是通过结合产生的子囊孢子，无性生殖主要以出芽生殖的方式。可以通过美蓝浸片法观察酵母菌形态和出芽生殖方式。美蓝无毒性，酵母活细胞能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，染色时具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或衰老细胞为蓝色或淡蓝色。子囊孢子是子囊类真菌的有性生殖产生的有性孢子，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴别的重要依据之一。酵母菌要形成子囊孢子需要一定条件，麦氏培养基（葡萄糖-醋酸钠培养基）有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。通过孔雀绿-番红复染法对酵母染色，使菌体和子囊孢子呈不同颜色，制片及显微观察，可以看到子囊孢子的形态和位置。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

酿酒酵母（S.cerevisiae）。

1.1.2培养基

麦芽汁液体培养基；麦氏（Meclary）琼脂斜面。

1.1.3溶液或试剂

0.1% 吕氏碱性美蓝染液，5%孔雀绿染液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，葡萄糖，氯化钾，酵母浸膏，醋酸钠，K2HPO4，蒸馏水，蛋白胨，酵母膏，琼脂。

1.1.4仪器

显微镜，载玻片，盖玻片，双层瓶，酒精灯。

1.2方法

1.2.1 液体培养基制备

1.2.1.1 取蛋白胨4g，酵母膏2g，葡萄糖4g放入约200ml水中，加热融化，待混合均匀后（呈深棕色）将水补充至200ml，然后将其分装到两个锥形瓶中，每个三角瓶中100ml。

1.2.1.2 113℃灭菌30min，取出，冷却，备用。

1.2.2麦氏培养基制备

1.2.2．1 取葡萄糖0.1g，氯化钾0.18 g，酵母浸膏0.25 g，醋酸钠0.82 g，2 g，琼脂2 g，蒸馏水100 ml。

1.2.2．2 按常规方法制备培养基后，装入10支试管，每支5mL左右。

1.2.2．3 将装好的试管与上步中液体培养基一起113℃灭菌30min。取出，静置，摆斜面。

1.2.3接种和培养

1.2.3.1 液体培养基将接种环用酒精灯灭菌，在酿酒酵母斜面培养基试管内冷却后，轻轻刮取适量酿酒酵母孢子。将带有菌种的接种环伸入液体培养基内，轻轻搅拌。将接种后的三角瓶至于恒温25-28℃箱中培养。1.2.3.2 麦氏琼脂斜面按常规方法接种，培养（即产孢培养）。

1.2.4美兰浸片观察

1.2.4．1滴加一滴0.1% 吕氏碱性美

蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环从液体培养基上去一环菌液置于染液中，混合均匀。 1.2.4．2 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 1.2.4．3 将制片放置约三分钟后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。 1.2.5 子囊孢子观察 1.2.5．1 菌种活化 将酿酒酵母接种至新鲜的麦氏琼脂斜面上，25-28℃

培养24h 左右，然后再转接2-3次。

1.2.5．2 产孢培养 将活化的菌种

转接到麦氏琼脂斜面上，25-28℃培养约一周。

1.2.5．3 制片 取经过产孢培养的

酵母斜面培养物，在洁净载玻片上按常规方法涂片、干燥、固定。

1.2.5．4 染色 滴加孔雀绿染液染

色1min 。

1.2.5．5 脱色 有无菌水冲洗，直至流出水为无色。

1.2.5．6 复染 用番红染液复染

30s ，水洗，用吸水纸吸干。

1.2.5．7 镜检 干后用油镜观察。

2结果与分析

2.1结果

图1 死活细菌显微观察（×400） 图2 子囊孢子显微观察（×1000）

显微观察酿酒酵母形态及其子囊孢子结果如下：

观察子囊孢子：子囊孢子位于酵母菌内，经过孔雀绿-番红复染，子囊

孢子呈绿色，菌体、子囊均呈红色。

2.2分析

通过美蓝染液染色，显微观察，可以观察到死细胞呈蓝色，活细胞呈无色，我们可以由此鉴别死活细胞。

通过比较图1、2，得知酿酒酵母有两种生殖方式：有性生殖（产生子囊孢子）和无性生殖（出芽生殖）。观察图2，酿酒酵母经过孔雀绿-番红复染后子囊孢子呈绿色，包裹在子囊内，菌体和子囊呈红色，每个菌体子囊孢子数为3-4个。由于子囊孢子在子囊中以三维结构排列，故在二维视野下多观察到两个孢子的联合体以及部分三孢子的联合体，少见同时能够看到四个孢子的联合体。

通过实验结果可以看出，能否产生子囊孢子，是否进行出芽生殖以及酵母菌形态特征是鉴别不同酵母菌的重要手段。

3小结

实验中应注意以下注意事项。美蓝浸片染色时染液不宜过多或过少，否则盖上盖玻片时菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；盖玻片不能平着放下，以免产生气泡；接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细菌。菌种菌龄也很重要，子囊孢子是否形成，影响实验观察。

4参考文献

[1]沈萍，陈向东. 微生物学实验 [M]. 4版.北京；高等教育出版社，2007

[2]沈萍，范秀容，李广武，微生物学实验 [M]. 3版.北京；高等教育出版社，

1999