色谱法的产生和发展

1906年，俄国植物学家Tswett发表了他的实验结果，他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。

他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）。

在此后的20多年里，几乎无人问津这一技术。

到了1931年，Kuhn等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，从此，色谱法开始为人们所重视，此后，相继出现了各种色谱方法。

色谱法的发展历史在分析化学领域，色谱法是一个相对年轻的分支学科。

早期的色谱技术只是一种分离技术而已，与萃取、蒸馏等分离技术不同的是其分离效率高得多。

当这种高效的分离技术与各种灵敏的检测技术结合在一起后，才使得色谱技术成为最重要的一种分析方法，几乎可以分析所有已知物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用。

1. 色谱法的优点分离效率高。

几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到分离，能解决许多其他分析方法无能为力的复杂样品分析。

分析速度快。

一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟的时间内完成一个复杂样品的分析。

检测灵敏度高。

随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以直接检测 10-9g 级的微量物质。

如采用预浓缩技术，检测下限可以达到 10-12g 数量级。

样品用量少。

一次分析通常只需数纳升至数微升的溶液样品。

选择性好。

通过选择合适的分离模式和检测方法，可以只分离或检测感兴趣的部分物质。

多组分同时分析。

在很短的时间内（20min左右），可以实现几十种成分的同时分离与定量。

易于自动化。

现在的色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。

2. 色谱法的缺点定性能力较差。

为克服这一缺点，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。

色谱法的定义与分类固定相（stationary phase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。

流动相（mobile phase）：与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。

色谱法：又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。

色谱法的分类方法很多，最粗的分类是根据流动相的状态将色谱法分成四大类色谱法基本原理基本概念1. 保留时间与容量因子在整个色谱分离过程中，流动相始终是以一定的流速（或压力）在固定相中流动的，并将溶质带入色谱柱。

溶质因分配、吸附等相互作用，进入固定相后，即在固定相表面与功能层分子作用，从而在固定相中保留。

同时，溶质又被流动相洗脱下来，进入流动相。

与固定相作用越强的溶质在固定相中的保留时间就越长。

从色谱柱流出的溶液（柱流出物）进入检测器连续测定，得到如图7-1所示的色谱图，即柱流出物中溶质浓度随时间变化的曲线，直线部分是没有溶质流出时流动相的背景响应值，称作基线（base line）。

在基线平稳后，通常将基线响应值设定为零，再进样分析。

溶质开始流出至完全流出所对应的峰型部分称色谱峰（peak），基线与色谱峰组成了一个完整的色谱图（chromatogram）。

死时间(dead time)：在色谱柱中无保留的溶质从进样器随流动相到达检测器所需要的时间，通常用t0表示。

溶质保留时间（solute retention time）：或称真实保留时间，是溶质因与固定相作用在色谱柱中所停留的时间，它不包含死时间，通常用t S表示。

保留时间（retention time）：是t S与t0之和，通常用t R表示，即t R = t0 + t S(7-1)容量因子（capacity factor）：对于有效的色谱分离，色谱柱必须具有保留溶质的能力，而且还能使不同溶质之间达到足够大的分离。

色谱柱的容量因子K’是溶质离子与色谱柱填料相互作用强度的直接量度，由下式定义：(7-2)式中V R和V0分别为总保留体积和空保留体积。

2. 色谱峰的对称性高斯（Gaussian）曲线：在理想情况下，色谱峰的形状可以近似地用高斯曲线描述（图7-2）。

图中Ó为标准偏差（拐点处的半峰宽），h为最大峰高，w为峰宽。

在任意给定位置x处的峰高y可以用下式描述：(7-3) (式中Y0为峰极大值，即Y=h）不对称因子（asymmetry）：在实际的色谱过程中，溶质从色谱柱中流出时，很少符合高斯分布，而是具有一定的不对称性。

我们可以定义一个不对称因子As 来定量地表示色谱峰的不对称程度，如图7-3所示，将10％峰高处前半峰的宽度设为a, 同高度处后半峰的宽度设为b，将b与a的比值定义为不对称因子As，即AS=b/a (7-4)拖尾峰（tailing peak）：当As大于1时，色谱峰的形状是前半部分信号增加快，后半部分信号减少慢。

引起峰拖尾的主要原因是溶质在固定相中存在吸附作用，因此，拖尾峰也称为吸附峰。

伸舌峰（leading peak或fronting peak）：当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，后半部分信号减小快。

因为伸舌峰主要是固定相不能给溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。

3. 分离度色谱分析的目标就是要将混合物中的各组分分离，两个相邻色谱峰的分离度R（resolution）定义为两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商，即(7-5)式中tR1和tR2分别为峰1和峰2的保留时间；w1和w2分别为峰1和峰2在峰底（基线）的峰宽，即通过色谱峰的变曲点（拐点）所作三角形的底边长度。

计算分离度所需的参数都可以从色谱图（图7-4）中获得.如果色谱峰呈高斯分布，则分离度R=2（相当于8Ó分离）即可完全满足定量分析的需要。

因为在基线位置的峰宽w为4Ó，R=2时，两个峰完全达到了基线分离。

通过调节色谱条件还可获得更高的R值，不过这时的代价将是分析时间增加。

如果两组分浓度相差不是太大，分离度R=0.5时，仍然可以看得出两个峰的峰顶是分开的。

4. 选择性系数两个组分达到分离的一个决定性参数就是两组分的相对保留值，将其定义为两个色谱峰真实保留时间tg之比，称作选择性系数α，即(7-6)计算选择性系数所需参数α也可以从色谱图（图7-4）中获得。

选择性系数主要由固定相的性质所决定，在高效液相色谱（HPLC）中，选择性系数α也受流动相组成的影响。

当选择性系数α=1时，则说明在给定的色谱条件下，两组分不存在热力学上的差异，无法实现相互分离。

色谱过程动力学色谱过程动力学研究物质在色谱过程中的运动规律，如解释色谱流出曲线的形状、谱带展宽的机理，从而为选择色谱分离条件提供理论指导。

用严格的数学公式表述色谱理论需要根据溶质在柱内的迁移过程及影响这一过程的各种因素，列出相应的偏微分方程组，求出描述色谱谱带运动的方程式。

其数学处理相当复杂，方程组的求解也非常困难。

在实际研究中，通常要进行适当的条件假设并作简化的数学处理。

在此仅作简单介绍。

1. 塔板理论塔板理论把气液色谱柱当作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念描述溶质在两相间的分配行为，并引入理论塔板数（the number of theoretical plates）N和理论塔板高度（theoretical plate height）H作为衡量柱效的指标。

根据塔板理论，溶质进入柱入口后，即在两相间进行分配。

对于正常的色谱柱，溶质在两相间达到分配平衡的次数在数千次以上，最后，"挥发度"最大（保留最弱）的溶质最先从"塔顶"（色谱柱出口）逸出（流出），从而使不同"挥发度"（保留值）的溶质实现相互分离。

理论塔板数N可以从色谱图中溶质色谱峰的有关参数计算，常用的计算公式有以下两式：（7-7）（7-8）为半峰宽；w为峰底宽（经过色谱峰的拐点所作三角形的底边宽）。

式中：b1/2理论塔高度H与理论塔板数N和柱长的关系如下：H=L/N （7-9）2. 速率理论为了克服塔板理论的缺陷，Van Deemter等在Martin等人工作的基础上，比较完整地解释了速率理论。

后来，Giddings等又作了进一步的完善。

速率理论充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。

当溶质谱带向柱出口迁移时，必然会发生谱带展宽。

谱带的迁移速率的大小决定于流动相线速度和溶质在固定相中的保留值。

同一溶质的不同分子在经过固定相时，它们的迁移速率是不同的，正是这种差异造成了谱带的展宽。

谱带展宽的直接后果是影响分离效率和降低检测灵敏度，所以，抑制谱带展宽就成了高效分离追求的目标引起谱带展宽的主要因素有涡流扩散（eddy diffusion）、纵向扩散（longitudinal diffusion）和两相中传质阻力（resistance to mass transfer)引起的扩散。

图7-5是色谱柱中溶质谱带展宽的几种主要因素的图示。

色谱过程热力学色谱过程热力学就是从热力学和统计力学的观点出发，研究溶质保留值随分析条件、分子结构变化的规律。

根据热力学公式RT lnK =和，可以得到（7-17）式中：K为溶质在两相间的分配系数，为吉布斯生成自由能，为焓变，为熵变，R为气体常数，T为热力学温度。

根据容量因子的定义，可以得到：（7-18）式中Vs 和Vm分别表示固定相和流动相体积，由式(7-17)和式(7-18)可以得到：（7-19）如果色谱条件一定，则可视为常数。

是热力学温度倒数1/T的函数，与1/T的关系曲线称为范特霍夫（vant Hoff）曲线。

范特霍夫曲线是以为斜率的直线。

对于吸热过程，小于零，直线的斜率为负；对于放热过程，大于零，直线的斜率为正。

气相色谱仪器气相色谱仪流程图气相色谱仪是一个载气连续运行、气密的气体流路系统。

气路系统的气密性、载气流速的稳定性及测量的准确性，都影响色谱仪的稳定性和分析结果。

图7-7是常用的双气路气相色谱仪的流程图高压钢瓶中的载气（气源）经减压阀减低至0.2-0.5MPa，通过装有吸附剂（分子筛）的净化气除去载气中的水分和杂质，到达稳压阀，维持气体压力稳定。

样品在气化室变成气体后被载气带至色谱柱，各组分在柱中达到分离后依次进入检测器。

减压阀图中7是高压气瓶与减压阀的连接口，气体经针阀4进入装有调节隔膜的出口腔5，出口压力是靠调节手柄1调节。

顺时针拧紧，针阀逐渐打开，出口压力升高；反时针旋松，出口压力减小。

稳压阀为后面的针形阀提供稳定的气压，或为后面的稳流阀提供恒定的参考压力。