最详细的流式细胞仪实验方法
最详细的流式细胞仪实验方法
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪（Flow cytometry）是一种高精度的细胞分析技术，可用于快速鉴定和分离多种类型的细胞。
本文将介绍一种常用的流式细胞仪实验方法，包括样品准备、细胞染色、细胞分析和数据分析等步骤。
一、样品准备1.收集细胞：制备单细胞悬液，如细胞培养物等。
2.细胞计数：使用细胞计数器或血细胞计数板等工具，计算细胞密度。
3. 调整浓度：根据流式细胞仪系统的要求，将细胞悬液的浓度调整至适当的浓度（一般建议在1×10^5至1×10^6个细胞/ ml之间）。
二、细胞染色1.封闭非特异结合位点：为了减少非特异性结合，可使用FBS（胎牛血清）或BSA（牛血清蛋白）等以阻断非特异位点。
2.添加荧光染料：选择合适的染料，如草酰胺（CFSE）、丙酮染料(ATTO)或FITC等。
按照厂家说明书中建议的浓度将染料添加到样品中，好洗脱或者可用来鉴定细胞的抗体，如表面标记、核酸染色剂或功能性抗体。
3.染色溶液：在4°C下孵育细胞悬液至少30分钟（具体时间根据实验需要决定）。
4.洗涤：向样本管中加入足够的缓冲液，使细胞悬液稀释五倍，并离心沉积细胞。
5.弃去上清液：将上清液弃去，然后用足够的缓冲液再次洗涤沉积的细胞。
6.重悬：向样品管中加入适量的缓冲液，使细胞形成合适的细胞密度。
三、设置流式细胞仪1.打开仪器：确保仪器已开启并运行正常，各通道和检测器已连接好，并预热至适当温度。
2.校正：根据仪器的手册，对流式细胞仪进行校正和标定，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
3.样品管固定：将样品管插入到流式细胞仪中相应的槽中，以确保准确读取。
4.设置参数：在计算机或流式细胞仪仪器的界面上设置所需参数，如细胞个数、细胞染色等。
四、细胞分析1.利用流式细胞仪：启动流式细胞仪软件，并确保硬件与软件连接正常。
2.定位细胞：在细胞分析开始前，调整激光位置和侦测器的灵敏度，以确保对准确获取细胞。
流式细胞仪实验流程
流式细胞仪实验流程英文回答：Flow cytometry is a powerful technique used in biological research to analyze and sort cells based ontheir physical and chemical properties. It allows researchers to study various aspects of cells, such as cell size, shape, granularity, and protein expression. Here, I will explain the general workflow of a flow cytometry experiment.1. Sample preparation: The first step is to prepare the cell sample for analysis. This involves isolating the cells of interest from tissues or cultures and ensuring their viability. The cells are then washed and resuspended in a buffer solution to maintain their physiological conditions.2. Instrument setup: Once the sample is ready, the flow cytometer needs to be properly set up. This includes calibrating the instrument using calibration beads toensure accurate measurements. The laser and detector settings are adjusted to detect the specific fluorochromes used for labeling the cells.3. Cell labeling: To analyze specific cell populations, cells are often labeled with fluorescent markers. These markers can be antibodies that bind to specific cell surface proteins or dyes that stain cellular components. The choice of markers depends on the research question and the cell types being studied.4. Data acquisition: The labeled cells are introduced into the flow cytometer, where they pass through a narrow flow cell one at a time. As the cells flow through the laser beam, the fluorochromes emit light signals that are detected by the instrument. The emitted signals are converted into electronic signals and recorded as data.5. Data analysis: Once the data is acquired, it needs to be analyzed to extract meaningful information. Flow cytometry software is used to analyze the data and generate graphical representations. Various parameters can bemeasured, such as cell population frequencies, cell cycle distribution, and protein expression levels.6. Cell sorting (optional): In some cases, flow cytometry is used for cell sorting, where specific cell populations are physically separated based on their properties. This is achieved by applying an electric charge to the cells as they pass through the flow cell. The charged cells are then deflected into different collection tubes, allowing researchers to isolate and study specific cell populations.Overall, flow cytometry is a versatile technique that provides valuable insights into cellular characteristics and functions. It is widely used in immunology, cancer research, stem cell biology, and many other fields.中文回答：流式细胞仪是一种在生物研究中广泛应用的技术，可以根据细胞的物理和化学特性对其进行分析和分选。
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）实验概要Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要试剂1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E) Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)1. 一次性12×75mm Falcon试管。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析(PI法)一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:没有染色的细胞(制备过程如下,仅不加抗体)三、实验步骤1.取对数期生长细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,1000rpm,离心10min弃上清;2.PBS洗2次,加0.5ml吹匀,务必吹散;3.加入70%预冷乙醇中(标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精),固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性)封口膜封口,4℃固定1-2h或过夜(可长至一个月);4.1000rpm×10min离心收集细胞,PBS洗两次;5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打;6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml,37℃水浴消化30min;7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml,室温避光染色30min;8.用300目滤网过滤,上机检测。
细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:没有染色的细胞(制备过程如下1-6)三、若做DNA倍体分析,需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管,比例至少为2:1四、实验步骤1. 将细胞消化后,用冷PBS洗细胞两次,300g×5min(若细胞数过少可提高转速到500g),为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心;2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团,加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。
流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法以下是流式细胞仪实验的一般步骤：1.预实验准备：a.准备所需样本：收集需要分析的细胞样本，如血液、细胞培养物等。
b.确定实验设计：根据实验目标确定分析的参数、染色方法和控制组设置。
2.打开仪器：a.打开流式细胞仪，并按照仪器说明书进行操作。
b.等待仪器预热，并确保仪器处于正常工作状态。
3.样本处理：a.预处理样本：根据实验需求，进行必要的样本预处理，如细胞培养、离心、洗涤等。
b.细胞染色：根据需要，对细胞样本进行染色。
例如，使用荧光标记的抗体来标记感兴趣的细胞表面标记物。
c.染色控制组：设置相应的染色控制组，用于确定背景噪音和染色特异性。
d.染色时间和温度：对于染色的时间和温度进行优化，确保获得最佳标记效果。
e.后续处理：根据实验需求，进行必要的后续处理，如溶解细胞红外染料、染色通道校准等。
4.仪器设置：a.确定分析参数：根据实验目标，选择合适的参数设置，如激光波长、增益和门限等。
b.检查仪器设置：检查仪器设置是否正确，如流速、流式细胞仪通道是否已校准等。
c.校准仪器：根据仪器说明书，进行仪器的标定和校准。
5.获得数据：a.导入样本：将染色的细胞样本装入流式细胞仪的样本装载仓，并设置相关参数。
b.数据获取：根据设置的参数，运行仪器开始数据采集。
收集细胞事件的信息，如散射光强度和荧光强度。
c.数据保存：将获得的数据保存为FCS格式。
d.检查数据质量：检查数据的质量，排除可能的仪器漂移和背景信号差异。
e.数据分析：使用流式细胞仪软件对数据进行分析和解读。
6.数据分析：a.数据清洗：根据需要，清洗数据，并删除可能的噪音和非特异信号。
b.数据解读：根据实验目标，解读数据并分析感兴趣的细胞亚群。
c.统计分析：使用统计方法对数据进行分析和比较。
7.结果呈现：a.数据可视化：使用合适的图表或图像软件绘制结果图，如直方图、散点图或流式图。
b.结果解读和讨论：根据结果进行解读和讨论，进一步分析结果的意义和潜在的影响。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法一、测定用乙醇固定的DNA的含量1、培养细胞的DNA含量的测定制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；附:细胞固定的一般步骤1)取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；2)300g离心5分钟，弃上清，反复两次；3)重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；4)将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。
在4℃条件下可保存2~3周。
注意：✧根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；✧将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；✧细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。
✧300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中；✧显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；✧加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；✧上机检测。
2、新鲜组织的DNA含量的测定1)用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；2)500g离心5分钟；3)弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；4)再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；5)上机检测。
3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定1)从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；2)用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；3)加入PI液1ml室温避光30分钟；4)调整细胞浓度为1×106/ml；5)上机检测。
二、细胞凋亡检测及相关分子检测1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）✧收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；✧离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞;✧1500rpm离心，5分钟，弃去PBS；✧加PI染液1ml，室温避光20分钟；✧调整细胞浓度5×105/ml；✧上机检测。
流式细胞术操作规程
流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。
以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。
一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。
2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。
3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。
4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。
二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。
2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。
3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。
三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。
2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。
3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。
4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。
5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。
四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。
2. 将样本离心并去除上清液。
3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。
4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。
五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。
2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。
3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。
4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。
5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。
六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。
2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。
流式细胞仪实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除流式细胞仪实验报告篇一：流式细胞术实验报告流式细胞术实验目的掌握流式细胞仪的工作原理掌握用流式细胞仪测量细胞群体DnA含量分布的方法了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用实验原理流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、Dn(:流式细胞仪实验报告)A、RnA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DnA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如g0/g1期的DnA含量为2c，而g2期的DnA含量是4c。
利用pI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DnA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器、材料与试剂仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、eppendorf管。
试剂：70％乙醇（保存于4℃），Rnase（-20℃保存），pI染液（避光保存于-20℃），pbs(ph7.4，保存于4℃)实验步骤样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。
2000rpm15min收集固定细胞，pbs洗2次。
用100μLpbs重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
加pI染液50μL和Rnase约2μL室温放置15min。
上机检测。
样品测定并使用modFitLT软件分析结果。
实验结果与讨论:所测样品中各周期时相的百分比：g1期68.48%g2/m期16.63%s期14.89%g2：g1=1:1.77cV12.16提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。
流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DnA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（Fcm综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式测actin操作方法
流式测actin操作方法
流式测actin操作方法涉及以下步骤：
1. 细胞的制备：首先，细胞需要经过适当的处理来保持其形状和完整性。
这包括使用缓冲液洗涤和悬浮细胞，将细胞固定以保持其结构，并使用渗透剂使细胞透明。
2. 标记actin：现在，将使用荧光标记将actin可视化。
这通常涉及使用荧光标记的抗体来识别actin，并通过与这些抗体结合的二抗来传递荧光信号。
3. 流式细胞术：准备好的细胞悬液将通过流式细胞仪进行分析。
这涉及将细胞单个传送到流式细胞仪中的流体流中。
流体流使细胞一个接一个通过检测器通过。
4. 激光束照射：通过使用激光束与细胞交互，可以激发荧光标记的actin并产生荧光信号。
具体要求仪器配置和激光设置以获取最佳结果。
5. 数据采集和分析：由于流式细胞仪能够快速记录细胞中荧光信号的数量和强度，因此能够收集大量数据。
这些数据可以用于进一步的分析和解释actin的动态行为。
需要注意的是，流式测actin的具体操作方法可能因流式细胞仪型号和实验目的的不同而有所不同。
因此，在进行实验之前，建议参考相关的仪器操作手册和文
献以获取详细的操作步骤和建议。
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。
细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。
因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。
本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。
实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。
凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。
通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。
2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。
然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。
3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。
4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。
荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。
5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。
期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。
6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。
使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。
流式细胞方法测定
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪操作步骤
流式细胞仪操作步骤一、样品准备1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。
2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。
3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。
4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。
二、样品上机1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。
2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。
3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。
4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
三、参数设置1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。
2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。
3. 确认仪器校准和定标工作已完成。
4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。
四、数据采集1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。
3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。
4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。
五、数据分析1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。
2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。
3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。
4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。
六、结果输出1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。
2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。
3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。
七、质量控制八、实验室清理。
快速掌握使用流式细胞仪进行细胞分析的方法
快速掌握使用流式细胞仪进行细胞分析的方法细胞分析是生命科学中的重要研究手段之一，而流式细胞仪作为一种高效、准确的细胞分析工具，被广泛应用于细胞学、免疫学、生物医学等领域。
本文将介绍如何快速掌握使用流式细胞仪进行细胞分析的方法，以帮助读者更好地利用这一技术进行科研工作。
一、流式细胞仪的基本原理流式细胞仪是一种能够实现细胞的快速、高通量分析的仪器。
其基本原理是将细胞悬浮液通过细管引入流式细胞仪中，然后通过激光照射细胞，测量细胞在不同参数上的散射和荧光信号，从而获取细胞的相关信息。
二、准备实验样本在使用流式细胞仪进行细胞分析之前，首先需要准备好实验样本。
样本可以是细胞悬浮液，也可以是组织细胞的单细胞悬浮液。
为了保证实验的准确性，样本的制备应遵循一定的操作规范，如细胞的处理、染色等。
三、设置流式细胞仪参数在进行细胞分析之前，需要根据实验的需要设置流式细胞仪的参数。
主要包括激光的选择和功率、滤光片的选择、检测通道的设置等。
不同的实验目的和细胞类型可能需要不同的参数设置，因此在设置参数时应根据实际情况进行调整。
四、样本的注射和分析在样本准备和参数设置完成后，可以开始进行样本的注射和分析。
首先将样本注入流式细胞仪的样本室中，然后启动仪器进行分析。
在分析过程中，需要确保样本的流速适中，以避免细胞堵塞或过度稀释。
同时，还需要注意细胞在仪器中的稳定性，避免因仪器震动等原因导致数据的不准确。
五、数据分析与结果解读流式细胞仪在分析过程中会生成大量的数据，因此需要进行相应的数据分析与结果解读。
常见的数据分析方法包括细胞计数、细胞分类、细胞周期分析、蛋白质表达水平分析等。
通过对数据的分析与解读，可以得出相应的结论，并进一步指导后续的研究工作。
六、常见问题及解决方法在使用流式细胞仪进行细胞分析的过程中，可能会遇到一些常见问题，如细胞堵塞、信号干扰等。
针对这些问题，可以采取相应的解决方法，如调整样本的稀释倍数、优化参数设置等。
流式细胞检测实验方法篇
流式细胞检测实验方法篇流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。
一、细胞表面染色步骤1. 样本准备①采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓）用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。
对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。
②加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
2. 红细胞裂解①需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。
将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育3-5分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步。
②加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
③重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。
④细胞计数，用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。
将100μL细胞悬液加入流式管中备用。
3. 封闭Fc受体封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。
①小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。
加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。
流式细胞仪实验流程
流式细胞仪实验流程英文回答：Flow cytometry is a powerful technique used to analyze and quantify various characteristics of cells. It allowsfor the simultaneous analysis of multiple parameters, such as cell size, granularity, and the expression of specific proteins or markers on the cell surface. In this response, I will outline the general workflow of a flow cytometry experiment.1. Sample preparation: The first step in a flow cytometry experiment is to prepare the sample. This involves obtaining a single-cell suspension from the tissue or cell culture and ensuring that the cells are in asingle-cell form without clumps. This can be achieved by enzymatic or mechanical dissociation, depending on the cell type. The cells are then washed and resuspended in a buffer solution.2. Staining: To analyze specific characteristics of the cells, fluorescent dyes or antibodies are used to label the cells. These labels can target specific proteins or markers of interest. For example, if we want to analyze the expression of a particular surface marker on immune cells, we can use a fluorescently labeled antibody that binds specifically to that marker. The cells are incubated with the fluorescent labels, allowing the antibodies to bind to their targets.3. Instrument setup: Once the cells are stained, the next step is to set up the flow cytometer. This involves calibrating the instrument using fluorescent beads of known size and intensity. The laser(s) and detectors are adjusted to ensure optimal detection and resolution of the labeled cells.4. Data acquisition: With the instrument properly set up, the sample is loaded into the flow cytometer. The cells are passed through a flow cell one at a time, and as they pass through a laser beam, the fluorochromes on the cells emit light. The emitted light is then detected by thecorresponding detectors, and the signal is converted into electronic data. This data includes information about the fluorescence intensity and scatter properties of each individual cell.5. Data analysis: After data acquisition, the collected data needs to be analyzed. Flow cytometry software is used to analyze the data and generate graphical representations. Various parameters can be measured, such as the percentage of cells positive for a specific marker, the mean fluorescence intensity, or the cell cycle distribution. Statistical analyses can also be performed to compare different samples or conditions.6. Interpretation: The final step is to interpret the results obtained from the flow cytometry experiment. This involves comparing the data to control samples or previous experiments and drawing conclusions based on the findings. For example, if the percentage of cells positive for a specific marker is higher in a disease sample compared to a healthy control, it may indicate an abnormality or disease state.Overall, flow cytometry is a versatile technique that allows for the analysis of various cellular characteristics. It provides valuable information about cell populations and can be used in a wide range of research areas, such as immunology, cancer biology, and stem cell research.中文回答：流式细胞仪是一种用于分析和定量细胞特征的强大技术。
流式细胞术操作步骤
流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。
以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。
根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。
2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。
碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。
RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。
磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。
流式细胞仪专用的上样管。
3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。
离心机：用于离心细胞。
二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。
2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。
3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。
4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。
5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。
三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。
2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。
乙醇的最终浓度应在 70%左右。
3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。
四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。
2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。
3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。
4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。
流式细胞仪检测步骤4.15
流式细胞仪检测步骤4.15流式细胞检测的步骤【人乳腺癌贴壁细胞流式检测】一、细胞铺板1.调整细胞浓度2.5×105，加2ml培养液于六孔板中置于培养箱中过夜，铺两板，次日加药,分别作用24h和48h。
2.分组设定：调补偿组：空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO组，FITC组，PE组实验组(FITC +PE组)：贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组实验组中每组检测两次.二、流式样品准备1.消化：选取处于对数生长期的细胞，收集旧培养基，培养基离心。
离心完毕后，离心管中剩2ml液体。
用来贴壁细胞的终止消化。
贴壁细胞用200ul 0.25%胰蛋白酶消化，消化5分钟，然后加2ml离心过的培养基终止消化。
2.离心：800r/min ,离心5min，弃掉上清液。
3.重悬：加2ml PBS重悬，涡旋成单细胞悬液。
将该细胞悬液转移到流式样品管中，离心，弃去上清液。
加300ulPBS重悬细胞。
4. 调补偿组：分别吸取贴壁细胞50ul细胞悬液于四个流式管中（此时细胞数至少为1×106/ml以上），分成四组，即空白对照组，FITC-ISO+PE-ISO 组，FITC组，PE组。
实验组（(FITC +PE组): 贴壁细胞组，DMSO组，姜黄素40组，榄香烯50组。
实验组中每组检测两次，故每组分别吸取50ul细胞悬液于两个流式管中。
空白对照组什么也不加，剩下的每组加相应的抗体10ｕl。
常温避光孵育20min。
5.孵育完成后，加1mlPBS重悬细胞，1000r/min,离心5min。
6.离心后垂直倒掉上清液,再加200ulPBS重悬细胞，进行上机检测。
三、操作注意1.消化细胞时要让胰酶自然消化，最好不要人工拍打，否则会成片脱落，影响结果的测定。
上机前的细胞最好是单细胞状态，不要粘连，以免对流式细胞仪造成损伤。
2.垂直倒掉上清液后，不要再进行二次倾倒，以免将细胞倒掉。
3.上机检测前，用锡纸把流式管包住，避光。
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流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。
3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。
这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。
通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。
此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。
这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。
4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。
大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。
而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。
因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。
在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。
5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。
为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。
第二部分细胞因子细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－)与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
具有其它方法难以比拟的优点：➢快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；➢简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；➢灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；➢高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；➢安全：减少样本处理与生物源性污染➢接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器1. 流式上样管及细胞培养皿或板2. 25%CO2，37℃孵箱3. 混匀振荡器4. 离心机5. 加样器、Tips6. 流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD 抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。
如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。
溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45圈定所有淋巴细胞CD3 圈定T淋巴细胞CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞4、激活剂①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）A. DMSO中调节浓度0.1mg/mLB. 分装(20L)，－20℃储存。
勿反复冻融C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液②Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mLB. －20℃储存C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液D. Ionomycin终浓度1g/mL细胞悬液③Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mLB. 4℃储存C. SEB终浓度10g/mL细胞悬液④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞⑤CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内①Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）A. 于DMSO中调节浓度5mg/mLB. 分装(20L)，-20℃储存。
勿反复冻融。
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液D. 激活最后4－5小时BFA终浓度10g/mL细胞悬液。
注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降②Monensin （eBioscience，目录号00-4505）6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。
含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）8、破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。
下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
人IFN-人TNF-人IL-1人IL-1人MIP-1/CCL3人MIP-1/CCL4小鼠IL-4方法10小鼠IL-5方法10小鼠IL-6方法11小鼠IFN方法9 or 方法12小鼠TNF-方法9为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂(如3uM monensin，10mg/ml的BFA)方法1: 只使用转染细胞检测方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1 (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时方法10: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。