第五章 杂合酶

• 功能域转移或交换的方式
（1）活性部位转移到同系蛋白上
E.G. 糜蛋白酶的2个表面环与胰蛋白酶的类似的环交换， 胰蛋白酶变成糜蛋白酶。
在结合底物的临近部位进行有限的氨基酸取代，可以将底 物专一性转移到同系蛋白的另外一个成员上 。
E.g. 枯草杆菌蛋白酶 （地衣芽孢菌）
枯草杆菌蛋白酶 解淀粉芽孢杆菌）
第二节 杂合酶的构建策略
基础：
蛋白质的功能部位可以从一个蛋白质 转移到另外一个蛋白质上，同时保持结构 的完整性，并获得新功能。
不同蛋白质之间被交换的成分可以是 个别残基（点突变）、二级结构成分、整 个亚结构或整个蛋白质。
催化功能
酶
功能部位
底物结合功能
• 为保留相同的基本功能（如动力学参数、底 物专一性、热稳定性、最适pH等），又具 有修饰的性质，通常在同系功能单位间交换 较短的成分，另外，还可吸收两个或更多的 功能单位，以产生双功能蛋白质或多功能蛋 白质。
例：用鼠源性单克隆抗体的B1-8重链可变区的 CDR序列替换人骨髓瘤蛋白Ig分子中的相应的CDR序列， 则可使人的 Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结 合特异性。
抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除 免疫源性。
这种改型抗体也称CDR移植抗体 (CDR grafting antibody)
二、杂合酶的构建策略
结构域融合，构建新的特异性限制酶。 识别结构域
DAN限制内切酶 非特异性的DNA裂解结构域
两结构域成为构建杂合酶的工具
5．融合蛋白
• 转移整个蛋白质，得到融合蛋白，既可以是双 功能的，也可以是多功能的融合蛋白。
• 标签结构域：由核心蛋白独立折叠而成，人
们很容易操纵它。指定多肽分布的结构域，机 体广泛用它们来将蛋白质分配到特殊的部位。 • 蛋白质与特殊标签结构域的融合已经成为蛋白 质工程的标准工具。
另一个抗体，以便转移抗原 识别专一性，降低免疫应答 。 • 抗体的抗原化-提高免疫应答
将抗原序列插入到抗体 的CDR区中，作为限制其构 象，提高免疫应答的手段。
CDR----互补决定区
• 用lgG骨架呈现RGD以结合整合素，在CDR3环 中插入，得到的分子对血纤维蛋白原受体具有高度 的亲和力。
• X射线分析其中一个三维结构，RGD区被很好的 固定了。
结构同源性物质互换功能基团
• 血管生成素 13个残基组成表面环
牛胰核糖核酸酶A 15个残基组成表面环
代替
杂合体，血管生成素的能力降低， 核糖核酸Βιβλιοθήκη Baidu活力增大，反之亦然。
功能域转移或交换的方式 （2）功能肽序列转移到宿主蛋白骨架上
• 功能肽序列以插入序列的转移，可限制构象的柔 性。
• E.G. 将抗原表位插入到不同受体细菌蛋白中，作为
1．点突变及二级结构互换
例：蛋白酶有一个共同的靶点可用来互换底物的 专一性。
通过互换3个残基，使地衣芽胞杆菌蛋白酶具有 解淀粉芽胞杆菌蛋白酶的底物专一性。
在谷胱甘肽还原酶和硫辛酰胺脱氢酶的辅酶结合 结构域交换残基，成功地将其辅因子的优先性从NADP 转变到NAD和从NAD转变到NADP。
相关酶同源序列的互换，导致酶活力的降低，又 通过点突变技术保持酶的活力。
优化酶的结构，提高功能的手段。
• 杂合酶可用于改变酶学或非酶学性 质, 是了解酶的结构-功能关系、以及 相关酶的结构特征的有力工具，不仅 如此，它还可以扩大天然酶的潜在应 用，甚至可以产生催化自然界不存在 的反应的新酶分子。
• 杂合酶方法的有效性和实用性已得 到了实验的证实。
二：杂合酶研究的意义：
第三节 杂合酶的制备方法
杂合酶的构建方法是DNA水平的基础操 作和酶学检测方法的结合，其实质是突变 （组装）和筛选。
在进化过程中，把来自不同酶分子的（亚） 结构域进行组装成为一个新的单一结构域， 或者把来自不同酶的本身没有活性的模块重 组起来，同时在一个进化体系中筛选，就可 能获得比亲本功能具有更高效率的、或者衍 生出新功能的子代重组体。
第 五 章 杂合酶
目录
第一节：概述 第二节：杂合酶的构建策略 第三节：杂合酶的制备方法 第四节：杂合酶的应用 第五节：杂合酶的展望
第一章 概述
一、杂合酶的概念 把来自不同酶分子的结构单元（单个
功能域、二级结构、三级结构或功能域） 或酶分子进行组合或交换，可以产生具有 所需性质的优化酶杂合体。由两种以上酶 成分构成。
• 活性部位： 催化基团、-转角、 -发夹等均可以取代不
相关蛋白质的相关序列，实现转移。 • 主、客体之间没有结构同源性。
3．功能域交换
• 功能域为杂合酶的构成组件，可通过交换获得具
有催化特性的酶。分子内交换和分子外交换。 关键：如何做到“无缝连接”
• E.G. S1家族的丝氨酸蛋白酶是由两个同源-桶亚结 构域组成，其界面形成活性部位裂隙。
1. 现有酶在相应的工业条件下，稳定性差或催化水平 低。
2. 工程菌生产的酶变性后形成包涵体，复性效率不 高，且对蛋白水解酶敏感。
3. 底物专一性或催化功能需要改变。 4. 需要具有催化新反应的酶（自然界不存在的）。
杂合酶出现是酶学发展的必然结果，蛋白质工 程在杂合酶的构建中发挥关键作用。
其构建利用了自然界进化的各种各样的性质以 及自然界用于进化酶的各种策略。
融合多肽被认为是一种将蛋白质靶向动物的方 法。构建能进攻引起特殊疾病细胞的毒性融合 蛋白是人们的期盼。
E.G. 融合多肽
• 将信号肽序列和E.coli主要脂蛋白的部分氨基
酸融合到外膜蛋白的5个跨膜片段上，从而构建 了载体多肽，成功用于几种酶的显示。如-内酰 胺酶、细菌内切葡萄糖酶等 • 从头构建双功能酶，执行偶联反应。如-半乳糖 苷酶和半乳糖脱氢酶的杂合体、半乳糖脱氢酶和 细菌荧光素酶的杂合体、苹果酸脱氢酶和柠檬酸 合成酶杂合体。 • 对偶联反应测量偶联酶系统的稳态活力，与孤 立酶相比提高了2-3倍。
用于表征与底物结合部位有关的其他独特的结 构域。用于研究相关酶结构域顺序对比的相对价值。
第五节 杂合酶的展望
杂合酶技术是将DNA水平上突变筛选与蛋白质 水平上的酶学研究相结合的一门综合技术。这一技 术的引入，使酶工程的研究摒弃了烦琐的蛋白质序 列研究和繁重的菌种选育这一传统做法，为加快构 建新酶和改进生物工艺过程开创了一条新路，它将 传统酶学活性筛选方法同简便的DNA重组技术有机 结合起来。
第三节 杂合酶的制备方法
– 同源扫描突变 – 反—内蛋白子的应用 – DNA增长截短法 – 同源基因的改组-----SCRATCHY库
第四节 杂合酶的应用
理论上：功能与空间折叠的关系、底物结合的 催化作用等 实践上：前药加工、代谢疾病治疗等
非催化特性的改变
创建新催化活性酶
产生双功能或多功能蛋白质
DNA与蛋白质研究技术的突破也必将推动杂合酶 技术的发展。它与合理设计互补，这将会是分子生 物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质） 分子，也将会是蛋白质工程学更加显示出强大的威 力和诱人的前景。
噢噢！
确定蛋白质的结构与功能关系
四：确定蛋白质结构与功能的关系
杂合酶常常被用来确定相关酶之间的差异，表征 给予酶特殊性质的那些残基或结构，一种酶具有这种 特殊性质，而另一种同系酶则不具备。
E.G.乳酸球菌（Lactococcus lactis）的两个高度
同源的蛋白酶融合成的杂合酶，被用于测定哪个残基 决定其裂解特异性，哪个决定其对s1-酪蛋白和β酪蛋白的裂解速度。
3个氨基酸残基
3个氨基酸残基
转移
具有前者的专一性
E.Coli 异柠檬酸脱氢酶
（-螺旋13个残基）
取代
异丙基苹果酸脱氢酶 （-转角11个残基）
工程化后的异 丙基苹果酸脱氢 酶又原来对NAD 优先100倍，改 变为对NADP优 先1000倍。
根据酶分子的模型，为避免空间装配问题， 建议做四个氨基酸的取代。稳定结合口袋， 需另外作4个残基取代。
方法：
非合理性设计法：
主要通过构建各种库，再从库中筛选出 所需性质的杂合体，实际上就是进化酶。
理性设计法：
要求对操作对象的结构和功能详尽了解， 才能实现结构元件从一个蛋白质转移至另一 个蛋白质，从而产生性能新奇的杂合体。
一、杂合酶成功的例子
1．重新设计DNA结合专一性蛋白质
蛋白质工程的前景： 制造具有特定折叠、特定功能的新蛋白质。 已能用体外DNA合成和重组DNA合成技术设计和 产生任何类型的多肽，但仅限于非常短的片段。 转移大片段多肽引起的问题：可能会扰动 蛋白质的适当结构和功能所需的精细网络系统。 同系蛋白质间调换暴露于溶剂中的功能残 基，重新设计蛋白质的专一性。
2．功能域替换或转移
功能域部位转移到具有天然结构的骨架上，是产 生新结合活力和新催化活力的“合理方法”，功能 部位确实可以从一个蛋白质转移到另一个蛋白质上。
例：锌指蛋白作为DNA 的结合元件，通过锌指结 构的重新设计，使其识别任何三联密码子，进而通 过一系列锌指结构的连接，构建对任意DNA序列特 异性的限制酶。
诱导针对所选肽序列的抗体的手段，从而不必合 成肽序列。
得到的杂合体均一，易于亲和纯化。
• 抗原分子表面能够决定抗原特异性的数个氨基酸 残基组成的特殊序列及其空间结构，称之为表位 （epitope），又称抗原决定簇（antigenic determinant）。
• 在免疫应答（immunologic response）中，根据抗 原受体（antigen-receptor）所识别的抗原表位的 不同，可以分为T细胞表位和B细胞表位。
• 另一种是按表位结构不同分为连续性抗原表位和 不连续性抗原表位。连续性抗原表位是由肽链上 顺序连续的氨基酸组成；不连续性抗原表位也称 构象型抗原表位（conformation epitope），是由 那些顺序上不连续但在空间上相互联系的氨基酸 组成。
• 抗体人源化-降低免疫应答 将CDR从一个抗体调换到
• 疏水结构和催化三联体（Ser,Asp,His）是保守的， 但围绕活性部位的表面环是可变的，它负责酶的各种 底物专一性和调节性质，因此， S1的丝氨酸蛋白水 解酶是通过亚结构域交换而产生新酶的很好的候选者 。
4．功能域与结构域的融合
• E.G.通过核酸结合功能域与一个辅助的水解酶的
结构域融合，构建杂合体酶。 • E.G. 限制酶的催化中心与一个特异性的DNA结合
锌指结构
在天然蛋白质骨架上引入活性部位，产生功 能蛋白质
• 优点：
1. 有助于理解底物-酶、辅酶-酶、DNA-蛋白质 、配体-受体、蛋白质-蛋白质之间相互作用专一 性的结构决定因素。 2. 可产生新的专一性，作为药物设计和发现的模 板。 3.有望用新的结构骨架，诱导特定序列的特定构 象或稳定预定活性部位的结构。 4.有可能构建特定的结构域，代表一套二级结构 模块，将活性序列转移到模块上，产生新功能酶 。 5.转移序列可在噬菌体表面稳定表达，可通过筛 选、分析而进行更换，以增加其生物活力，获得 具有特定功能的人工蛋白质。
E.G.
1985年，研究者将434阻抑蛋白DNA识别 的氨基酸（-螺旋外表面）用P22阻抑蛋白 识别的相应氨基酸去取代，结果杂合蛋白的 结合专一性都是P22阻抑蛋白的专一性。
专一性改变
2．抗体间CDR的交换转移抗原识别专一性
改型抗体(Reshaping antibody)：Ig分子中参与构 成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定 区 (CDR区)。
• RGD：Arg-Gly-Asp 组成的三肽，为人纤维 连接蛋白与其受体的结合位点，存在于许多细胞的 粘附蛋白中，可被细胞表面的受体整合素所识别。
• 将三肽安装到已知结构的不同蛋白质上，用于固 定该蛋白质的构象，强化了与整合素受体的专一性 结合。
（3） 转移活性部位到一个新的结构上
• 将结构清楚地活性部位转移到结构不相关的蛋白 质上，仍保留转移部位的结构和功能。
锌指结构
锌指（zinc fingre）： 一种常出现在DNA结合蛋白中的一种结构模块， 是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4 个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2+构成，形成的结 构像手指状。
锌指结构:
在很多蛋白中存在的一类具有指状结构的结构域， 这些具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达的调控 有关的功能蛋白。