柱色谱分离试验

吸附剂装填紧密，排除 气泡。最终应使吸附剂的上 端平整，无凹凸面，无断层。
装柱
? 装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝 ，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影 响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球 等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密， 排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整， 无凹凸面．
三、实 验 内 容
柱色谱 Column Chromatography
一、实 验 目 的
了 解：
1. 柱色谱法分离有机物的原理。 2．固定相和流动相的选择原则。
掌 握：
1. 色谱柱的填充方法。 2．柱色谱分离的基本操作。
色谱法简介
色谱法亦称色层法， 层析法等，是 分离，纯化 和鉴定 有机化合物的重要 方法之一，还可 定量分析。
力弱、解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、 解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实 验以硅胶为吸附剂，95% 乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸 馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。
三、实实验验步 内骤: 容 柱色谱操作 ：
?干法：10g 硅胶 +乙醇
?先用乙醇 后用水 ?操作
?组分颜色
装柱
加样
洗脱
收集
鉴定
?1mL 样品 ?加样操作 ?0.5mL ×2乙醇洗涤
?组分颜色
仪器和试剂
? 1.仪器 ? 锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱 ? 2.试剂 ? 柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇（95%）甲
基橙、亚甲基蓝。
? H2O∶ 95 %乙醇 = 1∶ 1 (A 液) ? 0. 2mol·L -1HCl∶ 95 %乙醇 = 1∶ 1 (B 液)
在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？
和 和
三、实实验验步 内骤: 容 柱色谱操作 ：
?干法：10g 硅胶 +乙醇
?先用乙醇 后用水 ?操作
?组分颜色
装柱
加样
洗脱
收集
鉴定
?1mL 样品 ?加样操作 ?0.5mL ×2乙醇洗涤
?组分颜色
三、实 验 内 容 装柱 ? 干法装柱 ? 湿法装柱
三、实 验 内 容
鉴定
试样有色 依据颜色直接鉴定
试样无色 可结合薄层色谱结果
四、注 意 事 项
? 玻砂防堵塞 ? 装柱需紧密 ? 加压不可大 ? 溶剂勿流干
小结
色谱法在有机化学中的应用:
? 分离混合物 ? 精制提纯化合物 ?利用比移值 (Rf)鉴定化合物 ? 跟踪反应进程
色谱法的特点:
小结
?分离效率高 复杂混合物 ,同系物,异构体等。
实验步骤（续）
? 加样： 当液面刚好流至脱脂棉平面相切时，立刻关闭活塞， 加入 5mL左右的 A 液 ,当 硅胶面又将要露出时 ,关紧活塞 ,用量筒准确加入 0. 50mL 以 A 液做溶剂的混合液 (含甲 基橙和亚甲基蓝各为 0. 400 g·L -1) 。
? 洗脱： 待此混合液将要渗入柱内时 ,立即用 A 液洗脱 ,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝 两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移 ,而其顶部蓝色带不移动 , 当黄色带到达柱底部时 ,更换接受器 ,全部收集此黄色带 ,洗脱时间约 10 min 。此后改 用B 液做洗脱剂 ,这时可看到蓝色带开始下移 ,当亚甲基蓝色带到达底部时 ,更换接受 器 ,全部收集此蓝色带 ,洗脱时间约 30 min 。
加样
样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选 择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管 壁慢慢加入至柱顶部，勿使 样品搅动吸附剂表面 。
洗脱
三、实 验 内 容
在柱顶不断加入洗脱剂，使 洗脱剂 永远保持有适当的量，不 要让洗脱剂表面流干 ，使流动相 流速适当。
?洗脱时应注意：
?（1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安 装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒 。逐渐出现色层带分离。
? 灵敏度高 1(10-9)
可以检测出 μg? g-1(10-6)级甚至ng? g-
级的物质量。
?分析速度快 几分钟或几十分钟内可以完成一个试样 分析。
柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝
实验原理
甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:
甲基橙
亚甲基蓝
由于甲基橙和亚甲基蓝的 结构不同,极性不同,吸附剂对它们 的吸附能力不同 ,洗脱剂对它们的解析速度也不同 ,极性小、吸附能
?（5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从 活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒 入垃圾桶里。
三、实 验 内 容
收集 试样有色 ，在层析柱上可直接观察。洗脱后
分别收集各个组分。
试样无色， 收集洗脱液时，多采用等份收 集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样 的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小， 分离效果越好。
二、实 验 原 理
固定相、流动相的物理状态
液—固色谱法 气—固色谱法 气—液色谱法
液—液色谱法
柱色谱法（column chromatography）
Βιβλιοθήκη Baidu
色
纸色谱法（paper chromatography ）
法 分 类
操作形式 薄层色谱法（TLC ） 气相色谱（GC）
高效液相色谱（HPLC ）
分离原理
吸附色谱法
分配色谱法
离子交换色谱法 排阻色谱
二、实 验 原 理
柱色谱分离示意图
洗脱剂(流动相) 混合物
吸附剂(固定相)
二、实 验 原 理 影响分离效果主要因素
化合物的结构：化合 物的吸附性和它们的 极性成正比
洗脱剂的极性：溶解 度适中、不反应、易 获取回收
吸附剂的性质：均匀、 表面积大、不反应、 吸附能力不同
装置图
洗脱
装柱
实验步骤
? 装柱：
? 1、装色谱柱： ? （1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂
直固定在铁架台上。 ? (2) 关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水（也是洗脱剂，至柱体积的
1/2） ? （3）填吸附剂：称取10g 硅胶于小烧杯中 ,加入 15mL 蒸馏水 ,用玻
璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱, 使其逐渐沉入底 部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，打开活塞，用小锥型 瓶承接, 控制滴速为1 滴／秒,装完后在上面加一层脱脂棉（ ，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面）。
?（2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层 的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！
?（3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底 部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。
?（4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定 的回收瓶中。