原代神经细胞培养方法重点讲义资料
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
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实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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☞ 主要内容 :
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实验原理
原代神经细胞培养方法解析
神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项一、原代细胞培养原代细胞培养是指直接从生物体获取细胞进行培养的过程。
原代细胞更接近体内细胞的生理状态，因此在研究细胞的生理功能和疾病机制方面具有重要意义。
（一）取材1、选择合适的组织来源：根据研究目的选择健康的动物或人的组织，如肝脏、肾脏、心脏、皮肤等。
2、无菌操作：在取材过程中，要严格遵守无菌操作原则，使用无菌器械和试剂，避免微生物污染。
（二）组织处理1、清洗：将组织用无菌的生理盐水或 PBS 缓冲液反复冲洗，去除血液和杂质。
2、剪碎：将组织剪成小块，一般为 1-2mm³大小。
3、消化：根据组织的类型和特点，选择合适的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，在 37℃条件下进行消化，使细胞分散。
（三）细胞分离1、过滤：消化后的细胞悬液通过滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。
2、离心：过滤后的细胞悬液离心，去除上清液，收集细胞沉淀。
（四）培养1、接种：将细胞沉淀用培养基重悬，接种到培养瓶或培养皿中。
2、培养条件：根据细胞的类型和特点，选择合适的培养基和培养条件，如温度、CO₂浓度、湿度等。
一般来说，细胞培养的温度为37℃，CO₂浓度为 5%。
（五）原代细胞培养的注意事项1、取材要迅速，尽量减少组织在体外的停留时间，以保证细胞的活性。
2、无菌操作至关重要，任何一个环节的污染都可能导致培养失败。
3、消化酶的浓度和作用时间要适当，过度消化会损伤细胞，消化不足则细胞难以分散。
4、培养初期要密切观察细胞的生长状态，及时更换培养基，去除死细胞和细胞碎片。
二、传代培养当原代细胞生长到一定密度后，需要进行传代培养，以扩大细胞数量，维持细胞的生长状态。
（一）细胞准备1、观察细胞：在传代前，要观察细胞的生长状态，确定细胞是否达到传代的密度。
2、消化：根据细胞的类型和特点，选择合适的消化酶进行消化，使细胞从培养表面脱落。
（二）细胞收集1、离心：消化后的细胞悬液离心，收集细胞沉淀。
《原代细胞培养实验》PPT课件
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实验内容：
❖ 动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎2-5个
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4
实验材料：
❖ 每组的超净台中有以下物品：
❖ 1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛 血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶； PBS(-)1 瓶
❖ 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分 钟。
❖ 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照 每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活, 胰蛋白酶。
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❖ 6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组 织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。
3在无菌状态下将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离加入40ml025的无菌胰蛋白酶用搅拌棒轻轻搅动4在温暖的环境中或置于37c培养箱中轻轻摇动15分5让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶
❖ 2. 100ml灭菌烧杯2个；
❖ 3、50ml离心筒2个
❖ 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个
❖ 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌 玻璃搅拌棒1个
❖ 5、细胞计数板1块；
❖ 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
❖ 7、酒精灯1台；
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试验操作步骤：
❖ 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
神经元原代培养_
神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。
以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。
原代神经元培养培训课件
精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。
80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
8)。
孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。
聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。
养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。
灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。
原代细胞的培养和建系ppt课件
? 血液细胞的取材
? 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽 取静脉外周血，或从淋巴组织中（如 脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离 细胞，取材时应注意抗凝。
? 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
? 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分 离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗 两次，再用培养液洗一次后即可培 养，不宜低温存放。
第四章 原代细胞的培养和建系
? 凡是来源于胚胎、组织器官及外周 血，经特殊分离方法制备而来的原 初培养的细胞称之为原代细胞。
? 凡是经传代方式进行再次培养的细 胞称为传代细胞。
? 若能稳定生长传至10-20代以上的细 胞可确立为细胞系。
? 单细胞经克隆、纯化并大量扩增所 形成的特性稳定的细胞群体称为细 胞株或克隆细胞。
? 剪切 ? 加液漂洗 ? 消化 ? 弃去消化液 ? 漂洗 ? 机械分散
? 消化分离法的注意事项
（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中 的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA 的抑制作用。
（2）胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不 能太长，以避免毒性作用。
（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液， 以避免毒性产生，而且动作要轻，以避 免膨松的细胞随漂洗而丢失。
2、幼鼠胚肾（或肺）取材
幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝 上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉 开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取 肺，或背部朝上固定在木板上，先将背 部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用 无菌法从背部打开腹腔取肾。
? 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤 （1）取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，
pH=8.0 左右时最强 ? 酶的浓度 ? 温度 ? pH ? 无机盐离子，钙、镁等有抑制作用 ? 消化时间
? 胶原酶（collagenase）消化法
细胞原代培养PPT课件
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
《原代细胞培养实验》课件
案例二：胰岛细胞的原代培养
要点一
总结词
要点二
详细描述
胰岛细胞是胰腺内分泌部分的主要组成部分，其原代培养 需要模拟体内环境，以保持细胞的正常生理功能。
胰岛细胞的原代培养需要使用特殊的基质和生长因子，以 促进细胞的生长和分化。同时，需要控制培养液中的葡萄 糖、胰岛素等物质的浓度，以模拟体内环境。在培养过程 中，还需要注意防止细胞凋亡和自噬等问题。
细胞生长状态
通过观察细胞形态，评估 细胞的生长状态，如贴壁 、增殖、融合等情况。
细胞排列
观察细胞在培养容器中的 排列情况，判断细胞的生 长密度和分布情况。
细胞生长曲线的绘制
01
细胞计数
在原代细胞培养的不同时间点进 行细胞计数，记录细胞的增殖情 况。
02
绘制生长曲线
03
生长曲线的分析
将不同时间点的细胞计数数据绘 制成生长曲线，分析细胞的生长 速率和生长周期。
选择适合细胞类型的基础培养 液，如MEM、DMEM等。
添加物
根据细胞类型和生长需求，添 加适量的生长因子、血清、抗
生素等。
pH值
维持适宜的pH值范围，通常 为7.2-7.4。
渗透压
保持适宜的渗透压，以避免细 胞因渗透压过高或过低而受损
。
细胞的传代与冻存
传代时机
在细胞生长达到适宜密度时进 行传代，避免细胞过度生长或
原代细胞培养的应用
原代细胞培养在药物筛选、肿瘤研究、组织工程、再生医学等领域具有广泛的应 用价值。
通过原代细胞培养可以研究细胞的生理功能、药物作用机制和毒理反应，同时也 可以用于制备组织工程材料和进行基因治疗等研究。
02
原代细胞培养实验步骤
原代神经细胞培养
原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。
2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。
3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。
包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。
4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。
取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。
2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。
3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。
4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。
注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。
5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。
6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。
7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。
8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。
9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。
神经胶质细胞的原代培养
星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养
1、取新生24h内的C57BL/6J乳鼠，在超净工作台中用75％乙醇浸泡3～5min消毒，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有HBSS液的无菌培养皿内。
2、用预冷的HBSS液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液，1:4与不完全培养基混合，37℃消化15min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12-K完全培养基终止消化，轻轻吹打。
3、800g离心5min，弃上清。
4、用DMEM／F12完全培养基制成单细胞悬液，以70目滤网过滤，吸取细胞悬液接种至预先已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
0.5h后将培养基移至已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内继续培养。
5、24h后轻柔换液。
以后每隔2～3d换一次培养液，且每次换液前用HBSS 液剧烈振荡洗涤2次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
6、7至8天后，当星形胶质细胞汇合并且覆盖的小胶质细胞暴露在星形胶质细胞层上或已经与星形胶质细胞层分离时，在轨道摇床上以180rpm摇动T25烧瓶120分钟以分离收集小胶质细胞。
加入新鲜的细胞培养基，并在240rpm下16小时继续摇动烧瓶以除去少突胶质细胞前体细胞（OPC）。
7、胰酶消化后的细胞移至培养皿中传代，培养2d后可用免疫荧光的方法进行细胞鉴定。
神经干细胞原代取材与培养
神经原代干细胞的取材及培养长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。
因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。
神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
一、神经干细胞神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。
原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。
神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。
②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。
③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。
总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。
二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养1.原代取材（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。
（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。
重复2-3次。
（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。
用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。
（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
神经细胞培养讲义
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuron
Confocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
缺点：1）仅能获得Ⅰ型胶质细胞
2） 成纤维细胞增殖能力更强 3）部分Ⅰ型胶质细胞体积变大 2 利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获 得
3 小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好
污染细胞的去除
1 成纤维细胞的污染：为Ⅰ型星型胶质细胞主要污染细 胞（用抗纤维结合素（fibronection)的抗体鉴别） 1）预防为主；取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，
• 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解
乳蛋白） 合成培养基（ＭＥＭ ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12 ＲＰＭＩ（１６４０） １９９ Ｌ－１５ ）等
常用的平衡盐溶液（g/L）
Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks
原始数据图，颜色表示荧光强度
Neuroblastoma cells on silicon wafer
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数）
b 悬浮生长型细胞（少数）
2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
原代神经元培养的概念
原代神经元培养的概念一、神经元的获取原代神经元培养的第一步是从动物脑组织中获取神经元。
通常，新生动物（如新生小鼠）的脑组织被用于这一目的，因为新生动物的神经元具有较强的增殖能力。
获取的神经元可以通过酶消化或物理分散法进行处理，使组织分离成单个细胞。
二、培养基的选择培养基是原代神经元生长的必要条件，它提供了神经元所需的营养物质、激素和生长因子。
为了维持神经元的生长和存活，需要选择适当的培养基，以满足神经元的特殊营养需求。
常用的培养基有DMEM、MEM、F-12等。
三、培养条件控制原代神经元培养需要在一定的条件下进行，包括温度、湿度、气体（如O2和CO2）浓度等。
这些条件对神经元的生长和分化有重要影响，因此需要精确控制。
温度的稳定性对于维持细胞活性至关重要，而气体浓度则影响细胞的代谢和pH值。
四、神经元的生长与分化在适宜的培养条件下，获取的神经元开始生长并增殖。
在生长过程中，神经元会通过突起与其他神经元建立连接，形成复杂的网络结构。
随着时间的推移，这些神经元还会分化成不同的类型，执行特定的功能。
五、神经元网络的建立在原代神经元培养过程中，神经元会形成复杂的网络结构。
这些网络通过突触连接，传递电化学信号，模拟生物体内的神经网络。
通过观察神经元网络的建立，可以深入了解神经元的生长和功能机制。
六、培养过程中的监测与观察在原代神经元培养过程中，需要定期对细胞进行监测和观察，以了解细胞的生长状态、形态变化以及是否存在异常。
可以使用显微镜、电生理技术等方法对神经元进行监测。
通过这些手段，可以及时发现并解决培养过程中出现的问题。
七、培养物的应用与价值原代神经元培养在科学研究、药物筛选和疾病模型构建等方面具有广泛的应用价值。
通过原代神经元培养，可以深入了解神经系统的生理和病理机制，为药物研发提供有效的工具。
此外，原代神经元培养还为神经系统疾病的动物模型提供了替代方案，有助于研究疾病的发病机制和治疗方法。
总的来说，原代神经元培养是一种重要的实验手段，有助于推动神经系统科学的发展和进步。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
细胞原代培养课时讲课文档
法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞 的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目 的细胞。
第三十六页，共77页。
(2)实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解） 和消化分离法。 A.机械分散法 方法:
无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布专 用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75 ％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养 细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过 多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。操作用具如移液 器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时 紫外线消毒。
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血液细胞的取材
血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如 脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。
骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁
PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。
➢用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚； ➢用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖 取材。
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3. 原代细胞的分离和制作
人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在 体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。
(1)悬浮细胞的分离方法
➢除实验必须的用品外，其它物品不得带入细胞室； ➢细胞室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内使用，不得随 意转移地点，以便他人顺利使用； ➢细胞室实施值日生负责制，值班人员负责检查室内是否保持清 洁整齐，督促违反规定者改正错误。
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神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。
二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。
在体外，分离培养的神经节在NGF 存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。
1．材料和方法取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。
用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。
鸡胚背根神经节的取材方法同前。
剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。
置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。
24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。
接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2.培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L);10%胎牛血清; 10%马血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。
脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5 % 马血清；NGF 20ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3．新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形,直径8-14μm, 胞体周围呈现一圈光晕。
神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。
接种后24h, 大部分贴壁细胞开始长出突起。
其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元, 突起细长,并可观察到突起末端的生长锥。
除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起, 它们向四周发出树枝状的神经突起。
培养2-3d 后神经元的突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的神经网络。
随着培养时间的延长, 神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密, 神经元胞体逐渐增大。
大鼠背根节神经元可维持培养2个月。
4．新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与新生大鼠相似,但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小。
神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。
小鼠背根节神经元亦可维持培养2个月。
5．鸡胚背根节神经元的生长分化和形态特征鸡胚背根节神经元的生长分化基本上亦与新生大鼠和小鼠相似。
但鸡胚背根节神经元以假单极为多见。
与大鼠或小鼠背根节培养神经元相比,神经突起分枝较少。
神经元胞体稍小,神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。
鸡胚背根节神经元亦可维持培养2个月。
三. 新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养交感神经系统在维持机体的正常功能和对环境的适应性反应中起着十分重要的作用。
交感神经细胞培养特别有助于神经细胞发育和可塑性研究，利用体外培养系统可进行交感神经细胞的发生、死亡、形态和生化发育、递质表形的获得，以及靶组织与传入纤维的突触形成的研究。
此外，通过体外培养系统可获得关于神经营养因子、激素，细胞因子等调节交感神经元发育的信息，了解传入纤维的输入以及与靶组织的联系的机制。
1．材料和方法实验用出生当天的昆明种小鼠，在无菌条件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖镊在解剖显微镜下找到气管两侧的颈总动脉,并以此为标志,在颈总动脉分为颈内外动脉交叉处找到上颈交感节, 取出上颈交感节, 置于含 1 % 胶元酶(Collagenase)和 1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)分散后，用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中，每皿2ml细胞悬液置。
置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。
24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养(Feeding)培养液培养。
接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2．培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L)；10%胎牛血清；10%马血清；NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。
脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5%马血清； NGF20 ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3．新生小鼠交感节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠交感节神经元在含 NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄膜或在皮层胶质细胞层上生长, 交感神经元的胞体一般为圆形, 有时亦可见椭圆或梭形,体积较大, 直径约8-14μm左右,胞体周围呈现一圈光晕,神经元的细胞核大多偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。
接种后24h, 大部分贴壁神经元开始长出突起。
培养2-3天后,神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络。
随着培养时间的延长, 神经突起网络变得更加稠密。
神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗, 神经元的胞体逐渐增大。
小鼠交感神经元可维持培养1-2个月。
四. 胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养，中枢神经系统包括脑和脊髓，脊髓是中枢的初级部分，其功能有二，一是传导感觉和运动冲动，二是完成躯体运动的基本反射。
脊髓突然被横断并与高级中级失去联系后产生脊休克。
因此，利用体外培养的脊髓腹角运动神经元进行脊髓损伤和修复的研究日益受到重视。
1．材料和方法用12-14d 胚龄的小鼠、12-14d 胚龄的大鼠、孵化10 d 的鸡胚，在无菌条件下取出胎鼠或鸡胚脊髓，剥除脊膜后,将整个脊髓腹侧面朝上置于平皿中，用微解剖镊和双面刀片沿脊髓中央管纵切两半，再将脊髓两侧的腹侧部分切下，将组织块切碎，用0.125% 胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培养箱中培养,24h 后倾去培养皿内种植培养液, 改用饲养培养液(同第二节)进行培养。
以后每周换液两次,每次更换50%的新鲜饲养培养液。
2．胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元的生长分化和形态特征胚鼠和鸡胚脊髓腹侧神经元培养12h后,大部分神经元可贴壁,贴壁神经元呈圆形,直径5-8μm,其中少数神经元开始伸出1-2个突起。
培养24h后, 神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络,培养的脊髓神经元以双极和多极为多见, 神经元呈圆形或椭圆形及多边形不等,胞核清楚,多数具1-2个核仁。
随着培养时间延长, 神经元突起进一步增多、增粗并延长,形成稀疏的神经网络, 神经元胞体逐渐增大。
多极胞体大的神经元逐渐增多,经胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)组化染色呈阳性反应。
此后，只要定期换液并适当抑制非神经细胞的过度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和鸡胚脊髓腹侧运动神经元在体外可维持培养2个月。
五. 新生大鼠海马神经元分散培养海马属大脑边缘系统，与情绪、学习及记忆有关，它具有明显的长突触传递的长时间程长时程增强（LTP）和长时程抑制（LDT）的能力。
LTP和LDP具有协动性、特异性、长时性的特点，目前已被认为是学习和记忆的基础。
而且海马组织常常是引起癫痫发作的病变部位，并且海马细胞对缺血、缺氧特别敏感。
这些特征反映了海马神经元的内在性。
例如，对缺氧的可塑性和易感性均与NMDA（N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受体的独特性质相关。