端粒酶逆转录酶小干扰RNA对胰腺癌Capan-2细胞抑制作用的

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对胰腺癌Capan-2细胞抑制作用的实验研究

倪晶;夏伟;庄菊花;吴翠华;沈金秀

1.上海市第七人民医院核医学科,200137

【摘要】目的：探讨RNA干扰（RNAi）对胰腺癌Capan-2细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的抑制效应。方法：化学合成靶向于hTERT基因的４个小分子干扰RNA（siRNA）序列，用阳离子脂质体为载体转染Capan-2细胞，分为siRNA1～4、siRNA阴性对照和空白对照6组。通过RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测胰腺癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平，并用MTS法检测细胞生长增殖。结果：siRNA1～4组hTERT mRNA相对表达量分别为0.51±0.22、0.56±0.19、0.44±0.13和0.89±0.21，端粒酶相对活性分别为0.60±0.15、0.63±0.16、0.17±0.12和0.72±0.16，siRNA１～４组hTERT蛋白相对表达量分别为0.47±0.21、0.52±0.19、0.10±0.11和0.84±0.15，其中siRNA1～3组的hTERT mRNA表达量、端粒酶活性和蛋白表达量与空白对照组的差异有统计学意义，P＜0.05。Capan-2细胞在转染后48h时的细胞增长平均抑制率分别为50％、54％、63％和18％。提示不同siRNA序列对Capan-2的转染效率不同，其中siRNA３组能显著下调hTERT mRNA和蛋白的表达水平，并能抑制端粒酶活性和促进Capan-2细胞凋亡，与空白对照组比较均差异有统计学意义，P<0.01。结论：靶向hTERT的RNAi能明显抑制Capan-2细胞的增殖，hTERT可作为胰腺癌基因治疗的靶点。

[关键词] 胰腺;RNA干扰;端粒酶

胰腺癌具有临床症状隐匿、病情进展快、早期诊断困难、预后差等特点。在全球范围内，病死率与发病率之比高达0.991[1]。在过去的几十年里，胰腺癌的治疗方法以及患者生存时间并未得到明显的提高和改善。随着分子生物学和基因组学的发展，尤其RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术的发现，有望为胰腺癌的治疗提供一种新的有效方法。研究发现，端粒酶与细胞的永生化及癌变密切相关，它的激活对肿瘤的发生和发展起着重要作用［２］。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是端粒酶的核心催化亚单位，在我们的前期研究中证实了通过ＲＮＡｉ技术下调肝癌Hep G2细胞和结肠癌sw480细胞的hTERT表达水平，可促进Hep G2细胞和sw480的死亡和凋亡［2,3］。但目前罕见靶向敲除hTERT对胰腺癌capan-2细胞增殖影响的报道，因此本研究利用RNAi技术靶向敲除capan-2细胞的hTERT，分析其对capan-2细胞增殖的影响，探讨其治疗胰腺癌的潜在价值。

１材料与方法

1.1 材料

capan-2细胞由中国科学院上海生命科学研究院购得，用含体积分数10%胎牛血清（Gibco）和100Ｕ/mL青霉素和链霉素的DMEM（Gibco）培养液在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养，维持对数生长期备用。

1.2 小分子干扰RNA的设计与合成

利用小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）靶点寻找工具（/techlib/misc/siRNA_finder）设计hTERT mRNA（GeneBank accession no.AF015950）开放可读框内靶向特定序列的4个不同siRNAs。所选siRNA序列进行BLAST检索以排除与人基因组其他序列结合。4个hTERT-siRNA序列分别为：siRNA1：正向链5’-3’:CAUGCGUCGCAAACUCUUUTT，反向链5’-3’:TTGUACGCAGCGUUUGAGAAA；siRNA2:正向链5’-3’:AUGCGGCCCCUGUUUCUGGTT，反向链5’-3’:TTUACGCCGGGGACAAAGACC；siRNA3：正向链5’-3’:GAGCCAGUCUCACCUUCAATT，反向链5’-3’GTCUCGGUCAGAGUGGAAGUU；siRNA4：

正向链5’-3’:CGGUGUACGCCGAGACCAATT，反向链5’-3’:GGGCCACAUGCGGCUCUGGUU。siRNAs 由上海吉玛制药技术有限公司（GenePharma,Shanghai）合成，每个siRNA在无菌无RNA酶的水中重悬，稀释到合适的工作浓度（20μmol/L）并储存于-80℃备用。实验分为６组，分别为siRNA1～4治疗组，1个阴性对照组和1个空白对照组，其中阴性对照组由与已知人类mRNA 无有效同源的杂乱阴性siRNA序列组成，用于整个研究的对照实验；每组细胞复５孔进行实验。

1.3 siRNA的转染

在转染前24h接种细胞于24孔板，每孔5×104个细胞，用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基（Invitrogen，不含抗生素）400μL培养。转染前4h弃培养基，更换为不含血清的opti-MEM○R I进行培养。根据Invitrogen公司Lipofectamine 2000TM转染试剂说明书，将每条siRNA等量（40pmol）的与Lipofectamine 2000TM转染试剂在100μL opti-MEM○R I混匀后室温下静置20min，然后加入到细胞培养的孔板中，细胞继续孵化6h后，弃培养基，用PBS洗后加入含有胎牛血清和抗生素的DMEM培养基继续培养一定时间后进行收集和分析。

1.4 siRNAs的细胞摄取根据羧基荧光素（c arboxy fluorescein，FAM）标记的阴性对照siRNA （GenePharma，上海）使用说明转染细胞，评估细胞摄取siRNAs情况。转染方法同前，转染FAM-siRNA的终浓度为80nmol/L。转染6h弃培养基，PBS洗2次，然后荧光显微镜（Eclipse Ti-s-Inverted Microscope System, Nikon,Tokyio,Japan）观察细胞，用Motic Images Advanced 3.2进行成像，并计算转染率。

1.5 mRNA的RT-PCR量化分析

实时RT-PCR转染后48h根据TRIzol试剂（Invitrogen）使用说明提取siRNAs转染细胞的总RNA，利用Thermo Scientific NanoDrop 1000(Thermo）测量总RNA浓度，然后取1μg总RNA利用RevertAid TM逆转录试剂盒（Fermentas）进行逆转录。取1μL所得反应产物进行实时RT-PCR 进行半定量分析，正向引物：5’-CTACGGCGACATGGAGAACAAGC-3’,反向引物：5’-CGCAGCCATACTCAGGGACAC-3’，PCR(95 ℃,30s；72℃,60s)，β-actin作为每次PCR分析的标准进行同步扩增（正向引物：5’-CCTGGCACCCAGCACAATGAAG-3’，反向引物：5’-GGGGCCGGACTCGTCATACTC-3’）。PCR按照Trans TM PCR分析的操作规程进行40个循环。hTERT mRNA引物和探针(TransStart Gene qPCR SuperMix)分别从上海生工生物工程有限公司和北京全式金生物技术有限公司提供。用２－△△Ｔ法进行hTERT表达水平相对定量分析［４－５］。

1.6 蛋白量的蛋白质印迹法检测

Capan-2细胞转染48h后收集细胞，根据Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)使用说明裂解细胞提取总蛋白，用Thermo Scientific NanoDrop 1000测量总蛋白量，取等量总蛋白用质量分数10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用PVDF膜进行转膜。接着，用Western封闭液（碧云天生物技术研究所）4℃封闭过夜后，于hTERT一抗（Santa Cruz Biotechnology,INC）的PBS中4℃孵育过夜。然后滤纸在与辣根过氧化物酶连接的驴抗兔IgG （Immunology Consultants Laboraory,Inc）孵育1h后BeyoECO Plus荧光检测试剂（碧云天生物技术研究所）增强发光，在荧光成像仪（Image station 2000MM，Kodak）上成像，采用软件（Kodak Molecular Imaging Software Standard Edition V5.0.1.30）分析结合的抗体，并采用光密度分析进行量化。采用β-actin为内参，其一抗、二抗购自Cell Signaling Technology○R Inc，U.S。

1.7siRNA抑制肿瘤细胞生长的能力

将对数生长期的肿瘤细胞，以每孔3×103个细胞接种于96孔板，根据前述方法用80nmol/L的siRNA进行转染，在转染结束后用PBS洗细胞，然后在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行孵化48h。根据MTS试剂盒（Genmed Scientifics A）使用说明进行操作，用酶标仪492nm 波长处测定各孔光密度（optical delnsity,OD）值，计算细胞生长抑制率。为证实细胞生