乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

摘要

目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml，低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。

关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析方法学验证

前言

乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。

1. 材料与方法

1.1 试剂盒

乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。

1.2 仪器

酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。

1.3 方法

1.3.1．溶液配置

1×PBS缓冲液的配置：称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g

Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/ml。。取6个2mlEP管，分别标记为S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul备用，按照下表稀释方案进行稀释。

表1 标准品的稀释方案

质控品的配置：50ul/well, 共5复孔需250ul，配置300ul备用，取3个2 mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，按照下表稀释方案进行稀释。表2 质控品的稀释方案

1.3.2．铺板方案

取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按照下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul。

空白对照加入1×PBS缓冲液。

表3 铺板方案

1.3.3．加样步骤

加入酶标抗体，50 ul/well，震荡。37℃电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次，加入A、B液, 50 ul/ well，37℃电热恒温培养箱温育15 min。加入终止液，50 ul/ well。酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开Micr oplate Manager 5.2软件，选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT 和报告模式，测定各孔吸收值。

2. 结果

2.1 标准曲线与线性范围

标准品理论浓度对应的实测OD值表4 实测OD值

以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.9973，显示具有良好的相关性

Absorbance(OD)

Conc(ng/ml)

图1 线性关系图

2.2 准确度（回收率）的验证

质控品理论稀释浓度对应实测浓度值表5 实测浓度值

质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个浓度梯度进行准确度（回收率）的验证。表6 准确度的验证

结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%，113.07%，满足限度要求在85%-115%的范围内，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为80.56%，满足方法定量限在80%-120%的范围内。3个浓度梯度的平均回收率为97.7%，显示准确性好。

2.3精密度的验证

2.3.1 板内精密度的验证

上表中RSD(%)这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数CV值，HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准。而3ng/ml,和1.5 ng/ml的变异系数CV为3.5%，3.7%，符合显示孔间重复性好，符合ng/ml级RS D水平的一般应<15%的要求，精密度高。

2.3.2 板间精密度的验证

从同一实验室中获取2组同样的数据，做板间精密度的验证。首先对同一实验条件下不同实验人员所获得的数据是否可用于板间分析做验证。

表8 板间精密度的验证

以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系。

Absorbance(OD)

Conc(ng/ml)

图2 线性关系曲线

以上标准曲线结果显示第二组数据的R2 =0.967，第三组数据R2 =0.991。第二组数据由于有一些孔与标准曲线偏离较大，但考虑到随机抽样与均数存在一定误差，还是可以用于统计学分析。下表对3组

数据做板间分析。

从表中3个组的数据比较可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分别为9.1 0%，12.06%，满足对ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，精密度高。而HBs Ag 1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不是很高，故以下对HBsAg理论浓度为1.5 ng/ml的三组数据做分析。

对HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的准确性，精密度分析表9 精密度分析

从上表可知第一组数据和第三组数据准确性差，精密度高。而第二组数据准确性高，而精密度相对于第一组和第三组数据要好。综上对于HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的这一低浓度梯度的板内准确性和板间精密度相对于高浓度的线性要差一些。

2.4 检测限（LOD）计算