黄曲霉毒素测定法
实验十一-食品中黄曲霉毒素B1的检测
4．植物油：
用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移 于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶 液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油 4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再 加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲 醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液 重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下 按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
二、实验原理：
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉 毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应， 多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入 酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。
三、仪器与试剂
（一）试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板； 2、抗体； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg×4）； 6、底物液A； 7、底物液B； 8、终止液； 9、PBS一T洗液； 10、一次性手套。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。
5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操 作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1 甲醇一PBS(20＋80)中。
（二）样品测定
1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； 底物液A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）； 阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻
3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）：
样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确 加人100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封 严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于 125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧 杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏 斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现 象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加 5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一 并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
黄曲霉的检测方法
黄曲霉的检测方法黄曲霉是一种常见的真菌，它能够在多种环境中生存并繁殖，包括食物、土壤和空气中。
黄曲霉产生的黄曲霉毒素对人体健康有一定的威胁，因此对黄曲霉的检测非常重要。
下面将介绍几种常用的黄曲霉检测方法。
1. 气相色谱法：气相色谱法是一种常用的检测黄曲霉毒素的方法。
该方法将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后使用气相色谱仪进行分析。
由于不同的黄曲霉毒素具有不同的化学性质，所以可以通过检测毒素的特定化合物来确定样品中是否存在黄曲霉毒素。
2. 高效液相色谱法：高效液相色谱法也是一种常用的检测黄曲霉毒素的方法。
该方法将样品中的黄曲霉毒素提取出来，然后使用高效液相色谱仪进行分析。
与气相色谱法相比，高效液相色谱法对样品的处理过程相对简单，分离效果较好。
3. 免疫学方法：免疫学方法是一种常用的检测黄曲霉的方法。
该方法使用特异性抗体与样品中的黄曲霉结合，然后通过标记物的信号来检测黄曲霉的存在。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光法。
免疫学方法具有操作简单、灵敏度高的特点，可以用于大规模的样品检测。
4. PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的检测黄曲霉的方法。
该方法利用黄曲霉的DNA进行扩增，并通过特定的引物和探针进行检测。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和高快速性的特点，可以快速检测出样品中的黄曲霉。
5. 传统培养法：传统培养法是一种直接检测黄曲霉的方法。
该方法将样品培养在含有特定营养物质的培养基上，然后通过观察菌落形态、颜色和特点来确定是否存在黄曲霉。
尽管传统培养法操作相对简单，但其结果需要较长时间才能得到。
除了以上提到的方法，还有其他一些新兴的检测黄曲霉的方法，如纳米技术、蛋白质质谱法等。
这些方法在样品处理、快速性、灵敏度和特异性等方面都有所改进和突破，可以更好地用于黄曲霉的检测。
总之，对于黄曲霉的检测，可以选择适合的方法进行，根据需要和实际情况选择不同的方法。
不同的方法有其优缺点，需要根据实际应用需求进行选择。
陈皮中黄曲霉毒素的测定法_液相条件摸索
测黄曲霉毒素方法：一．（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul(2)色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)533 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5: 125: 5: 125 (ng/ml)602 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5: 10: 2.5 (ng/ml)603（二）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.5ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)544 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25: 1:0.25 (ng/ml)545色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25: 1:0.25 (ng/ml) cromasil150柱604（三）（1）色谱条件色谱柱：依利特C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（40:18:42）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.3ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)594 (四)（1）色谱条件（到此方法时，荧光灯的灯能量快不行了。
峰面积也受影响了。
）色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=0.5:0.125: 0.5:0.125 (ng/ml)534 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25:1:0.25 (ng/ml)535 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10:2.5:10:2.5 (ng/ml)598（五）（1）色谱条件（从这一步开始，换了新的荧光灯）色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.6ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5:10:2.5 (ng/ml)611（六）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.5ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5: 1.25:5:1.25. (ng/ml)608 色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=10: 2.5:10:2.5(ng/ml) cromasil150柱609（七）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.3ml/min进样量：20ul(2)色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=1:0.25:1:0.25 (ng/ml).597（八）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：水（45:55）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）色谱图标品浓度B1：B2：G1：G2=5:1.25:5:1.25 (ng/ml)538 陈皮样品色谱图（一）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：乙腈：水（30:14:56））荧光检测器：激发波长365nm，发射波长450nm；光化学柱后衍生法流速：0.6ml/min进样量：20ul（2）陈皮色谱图2个重复616617（二）（1）色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱，150*4.6mm，5um流动相：甲醇：水（45:55）荧光检测器：激发波长365nm，发射波长455nm；光化学柱后衍生法流速：0.8ml/min进样量：20ul（2）陈皮色谱图541（十）分析结果一览表结论：药典中关于黄曲霉毒素的测定法，步骤比较简单。
黄曲霉毒素的测定(精)
取20.00mL甲醇水溶液臵于另一125mL分液漏斗 中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静臵分层， 如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出 三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿 润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于 50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗 中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发 皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并 于蒸发皿中。
再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠
的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样 液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确 认试验 .
(5)稀释定量：
若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。 若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质 干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。 3.2.3 结果计算
(2)展开：
a．横向展开：在展开槽内的长边臵一玻璃支架，加10mL无水 乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，臵于展开槽内展开， 展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至 10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化 钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。 其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其 在食品中允许量各国都有严格规定。 AFT主要污染粮油及其制品，如花生、 花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严 重。Biblioteka 曲霉毒素允许量标准
食品品种 允许量标准（ppb或10-6） 玉米、花生、花生油 ≤20 玉米及花生制品 ≤20 大米、其他食用油 ≤10 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 婴儿代乳食品 不得检出
实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素
实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素一、实验目的了解ELISA的基本原理，及其优缺点；掌握间接ELISA法的试验操作过程。
二、实验原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。
本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。
将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。
三、实验器材1、ELISA试剂盒其组成如下：1.1 包被抗体的反应板48孔1.2 A试剂：样品稀释液l瓶1.3 B试剂：AFB1标准溶液l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)1.4 C试剂：酶标抗原l瓶1.5 D试剂：酶标抗原稀释液l瓶1.6 E试剂：浓缩洗涤液l瓶1.7 F试剂：显色底物液a l瓶1.8 G试剂：显色底物液b l瓶1.9 H试剂：终止液l瓶1.10 反应板框架l块2、仪器1.1酶标仪(内置450nm滤光片)1.250µL微量移液器及配套吸头1.3 恒温培养箱(0℃-50℃)1.4冰箱(4℃-8℃)1.5 感量0.0lg的天平1.6调速振荡器或超声波清洗器1.7 离心机5000r/min1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等1.8 小型粉碎机或碾钵1.9其它：滤纸，吸水纸等四、实验步骤1、实验准备1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表”1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素检测方法
一、黄曲霉毒素检测方法二、黄曲霉毒素的临床特征三、黄曲霉毒素中毒的急救措施
黄曲霉毒素检测方法1、生物鉴定法可检测黄曲霉素
其特点是待检样品不需很纯,主要用于定性,共有10种:抑菌试验;对微生物遗传因子影响试验;细菌发光试验;荧光反应;组织培养检测法;鸡胚试验;鸭胚试验;鳟鱼试验;植物试验;饲喂实验动物试验。
生物鉴定法是利用AFT能影响微生物、水生动物、家禽等生物体的细胞代谢,来鉴定AFT的存在。
其方法专一性差,灵敏度低,一般只作为化学分析法的佐证。
2、化学分析法可检测黄曲霉素
最常用的为薄层层析法(TLC),适用于粮食及其制品、调味品等AFB1的检测,主要是半定量。
利用AFB1具有荧光性的特点,提取和浓缩样品中的AFB1,用单向或双向展开法在薄层上分离后,在365nm紫外光照射下产生蓝紫色荧光,根据在薄层上显示荧光的最低检出量定量,其灵敏度为5μg/kg。
由于薄层层析法测定AFB1不是很专一,因此样品中其他荧光物质的干扰造成测定误差。
3、仪器分析法可检测黄曲霉素
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代初发展起来的一种以液体为流行相的新型色谱技术。
是分离分析各种AFT的好方法,如配以荧光检测器,则该法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠等优点。
在国外己广泛地用于食品中AFT的测定。
但由于食物样品成分复杂,在进行液相色谱分离分析前,需对样品作彻底有效的净化处理。
常用的净化方法是柱色谱法,该法操作繁琐,且需使用大量有机溶剂。
2019版药典黄曲霉毒素检验法-3页精选文档
2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。
衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。
即得。
测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
黄曲霉毒素检测标准方法汇总
流动相的梯度变化表（GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
标准方法检出限（GBT 23212-2008）
次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。
另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。
此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。
若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。
所得溶液的浓度约为50g/L。
污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）
AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）。
农药及黄曲霉毒素的测定及安全处置
添加标题
测定方法：农药残留的测定方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法等；黄曲霉毒素的 测定方法主要包括免疫分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。
添加标题
测定流程：农药残留的测定流程主要包括样品采集、样品处理、仪器分析等步骤；黄曲霉毒素的测 定流程主要包括样品采集、提取、净化、仪器分析等步骤。
添加标题
测定意义：农药及黄曲霉毒素的测定对于保障食品安全、维护人类健康具有重要意义。通过对农药 残留和黄曲霉毒素的检测，可以及时发现食品中的安全隐患，有效预防和控制食品中毒事件的发生。
气相色谱法：适用于多种农药残留的测定，具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等 优点。
液相色谱法：适用于极性强、分子量大的农药残留测定，具有高分离效能、高分辨率 等优点。
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美国：建立农药及黄曲霉毒素注册 登记制度，实施风险评估和安全管 理
中国：制定农药及黄曲霉毒素管理 法规，实施农药登记和残留限量标 准
添加标题
农药管理条例：规定了农药生产、经营、使用和监督管理的规定，确保农药的安全性和有效 性。
添加标题
农产品质量安全法：要求农产品生产者遵守农药使用规范，确保农产品的质量安全。
汇报人：
随着科技的发展，新型农药和黄曲霉毒素的防治手段将不断涌现，为食品安全提供更可靠的保 障。
政府将加强对农药及黄曲霉毒素的监管力度，制定更严格的法律法规，确保食品安全的可持续 性。
科研机构和企业将加强合作，共同研发更高效、环保、安全的农药及黄曲霉毒素的测定和防治 技术，推动农业可持续发展。
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避免食品在高温、高湿环境 下存放
保持食品干燥，避免食品受 潮
食用前检查食品的保质期， 避免食用过期食品
中药中黄曲霉毒素的测定
• 1962年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致 火鸡死亡的病因，后被证实为黄曲霉的代谢产物， 故命名为“黄曲霉毒素”。
黄曲霉毒素的化学结构
• 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，已 分离鉴定出12种包括B1，B2，G1，G2，M1，
黄曲霉毒素的理化性质
• 稳定性： 对热稳定，分解温度300℃； 紫外线对黄曲霉毒素有一定的破坏作用； 中性和酸性溶液中很稳定， 在强碱（pH9-10）溶液中可迅速分解， 5%的次氯酸钠溶液可瞬时破坏毒素
黄曲霉毒素的危害
• 毒性极强
黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌 物，毒性比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素， 是目前已知霉菌中毒性最强的。
免疫亲和柱
泵ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ操作架
全自动固相萃取仪 光化学衍生器
HPLC—荧光检测器
四、我国现行法定检测方法
•提取
高速搅拌2分钟 （>11000r/min）
样品+NaCl 3g 70%甲醇75ml
离心5分钟 （2500r/min）
取上清液15ml，置 50ml量瓶中，用水 稀释至刻度
0.45μm滤膜滤 过，取续滤液 20.0ml
陈皮、大枣、柏子仁、、薏苡仁 胖大海、莲子、桃仁、槟榔、麦芽 • 动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣 • 共19种
三、黄曲霉毒素现有检测方法
• 薄层色谱法（TLC）：对仪器要求低， 但前处理繁琐，有机试剂使用量大，灵 敏度低，定量困难；
• 酶联免疫吸附法( ELlSA)：方便快捷，但 部分中药具有与黄曲霉毒素相似的化学 成分，易产生假阳性、假阴性结果。
二、黄曲霉毒素检测药典收载情况
2015版药典黄曲霉毒素测定法
2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。
当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 - 乙腈 - 水(40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测， （1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g， 加入甲醇 100ml 使溶解， 用水稀释至 1000ml 制成)， 衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃； （2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm） ；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。
混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、 黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素是引起动物和人类食物中毒的常见真菌毒素之一。
为了确保食品的安全和质量，需要对食品样品中的黄曲霉毒素进行检测。
下面介绍几种常用的黄曲霉毒素检测方法。
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC是一种常用的分离、鉴定和测定食品中黄曲霉毒素的方法。
该方法使用高效液相色谱仪通过不同的分离柱，将样品中的黄曲霉毒素与其他组分分离开来，并根据其唯一的吸收特性进行检测和定量测定。
2. 气相色谱法（GC）：GC是一种基于样品中物质的挥发性的分离和检测方法，可以用于测定黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。
该方法需要将样品进行预处理，如萃取、净化等，然后通过气相色谱仪进行分离和检测。
3. 免疫测定法：免疫测定法是一种基于抗原与抗体特异性结合的原理进行黄曲霉毒素检测的方法。
常见的免疫测定法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。
这些方法操作简便、快速，可以实现对大量样品的高通量检测。
4. 质谱法：质谱法是一种可靠的黄曲霉毒素检测方法。
质谱法主要包括质量光谱（MS）和质谱联用技术（LC-MS/MS）。
这些方法通过样品中黄曲霉毒素的特征峰进行检测和定量，并具有高灵敏度和高选择性的优势。
以上是几种常用的黄曲霉毒素检测方法，每种方法都有其优缺点，选用合适的方法应根据样品特性、设备条件、经济性和检
测需求来决定。
为了确保食品的安全，建议将不同的检测方法结合使用，以提高检测的准确性和可靠性。
黄曲霉毒素b1国标检测方法
黄曲霉毒素b1国标检测方法
黄曲霉毒素B1的国标检测方法包括薄层分析法（TLC）、液相色谱法（HPLC）、酶联免疫法（ELISA）、毛细管电泳法（CE）和荧光光度法（IAC/SFB）等。
其中，薄层分析法是经典的检测方法，其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将黄曲霉毒素B1从样品中提取出来，经溶剂萃取纯化，再在薄层板上层析展开，分离，利用黄曲霉毒素B1的荧光特性，根据荧光斑点的大小和强弱，比较测定黄曲霉毒素含量。
液相色谱法是一种定性和定量准确的方法，检测速度快且检测限低，可作为仲裁法使用。
酶联免疫法是根据抗体和抗原之间特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度。
毛细管电泳法是一种国际上较为新的分析方法，该方法与激光减弱荧光检测器（LIF）连用可以很好地提高灵敏度。
荧光光度法也是常用的国标方法。
此外，胶体金检测法也是一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法。
该方法以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液到达指定位置反应、显色来检测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
具体操作时，样品中的黄曲霉毒素B1与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体与检测线（T线）上的黄曲霉毒素B1-BSA偶联物之间的结合，导致T 线颜色变化，通过T线颜色的有无来判断黄曲霉毒素B1是否超标。
无论样品中黄曲霉毒素B1的含量高低，质控线（C线）均显色，以示检测有效。
食品中黄曲霉毒素的测定
食品中黄曲霉毒素的测定
食品中黄曲霉毒素的测定方法主要有以下几种：
1. 同位素稀释液相色谱-串联质谱法（ID-LC-MS/MS法）：该方法是目前测定食品中黄曲霉毒素的主要方法之一，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。
该方法使用同位素稀释液对样品进行稀释，然后通过液相色谱-串联质谱法进行分离和检测。
2. 高效液相色谱-柱前衍生法（HPLC-FLD法）：该方法是一种传统的测定方法，具有操作简便、成本低等优点。
该方法使用高效液相色谱进行分离，然后通过柱前衍生法进行检测。
3. 气相色谱-质谱法（GC-MS法）：该方法也是一种常用的测定方法，具有灵敏度高、准确性高等优点。
该方法使用气相色谱进行分离，然后通过质谱法进行检测。
4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）法：该方法是一种快速、简便、经济的测定方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点。
该方法使用特异性抗体进行检测。
以上是常见的几种食品中黄曲霉毒素的测定方法，具体选择哪种方法需要根据实际情况进行考虑。
版药典黄曲霉毒素测定法
2351 黄曲霉毒素测定法第一法1 本法系用高效液相色谱法(通则 0512)测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉 毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2 总量计)，除另有规定外，按下 列方法测定。
当测定结果不符合规定时，以第二法测定结果为准。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水 (40∶18∶42)为流动相；采用柱后衍生法检测，（1）碘衍生法：衍生溶液为 0.05％的碘溶液 (取碘 0.5g，加入甲醇 100ml 使溶解，用水稀释至 1000ml 制成)，衍生化泵流速每分钟 0.3ml， 衍生化温度 70℃；（2）光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发 波长 λex=360nm(或 365nm)，发射波长 λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于 1.5。
混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 G2 标示浓度分别为 1.0μg／ml、0.3μg／ml、1.0μg／ml、 0.3μg／m1)0.5ml，置 10ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液 1ml， 置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠 3g，置于 均质瓶中，精密加入 70％甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟(搅拌速度大于 11000 转／分钟)， 离心 5 分钟(离心速度 2500 转／分钟)，精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至 刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液 20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟 3ml，用水 20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱， 收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
黄曲霉毒素测定
同单向展开法。
3.2.4 说明及注意事项
用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25g ／L)，浸泡消毒后再清洗之。
20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来， 对层析的结果产生一定影响。 • 硅胶H――不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。 • 硅胶HF254 ――掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。 • 硅胶GF254――含石膏及荧光物质。
黄曲霉毒素B1标准溶液
展开与观察
•
在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。
再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开
10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：
•
a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标
准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上
第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中AFTB1
• 黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物 质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其在食品中允许量各国都有严格 规定。
• AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染 严重。
黄曲霉毒素允许量标准
• 食品品种 允许量标准（ppb或10-6）
• 玉米、花生、花生油 ≤20
次氯酸钠溶液
• 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均 匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于 500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。 此液含次氯酸25g／L。
• 思考题： • 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？ • 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可
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黄曲霉毒素测定法
第一法
本法系用高效液相色谱法（附录8）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，采用柱后衍生法检测，①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②以光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm （或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度1100转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱（AflaT-est@P）,流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用水稀释至
刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
另精密吸取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
第二法
本法系用高效液相色谱一串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计)，除另有规定外，按下列方法测定。
色谱、质谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以l 0mol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B;柱温25℃;流速每分钟0.3m1;按下表中的规定进行梯度洗脱。
以三重四极杆串联质谱仪检测;电喷雾离子源( ESI) ,采集模式为正离子模式;各化合物监测离子对和碰撞电压(CE)见下表。
系列混合对照品落液的制备精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml)适量，用70%甲醇稀释成含黄曲霉毒素B2、G2浓度为0.04～3ng/ml，含黄曲霉毒素B1、G1浓度为0.12～10ng/ml，的系列对照品溶液，即得(必要时可根据样品实际情况，制备系列基质对照品溶
液）。
供试品溶液的制备同第一法。
测定法精密吸取上述系列对照品溶液各5ul.注入高效液相色谱一质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。
另精密吸取上述供试品溶液5ul，注入高效液相色谱―串联质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的浓度，计算，即得。
【附注】（1）本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
（2）残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
（3)当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。