扫描电镜及其制样技术
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扫描电镜技术
Techniques of Scanning Electron Microscope
一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术
（一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法
2020/3/31
2020/3/31
一、扫描电镜的基本结构 与成像原理
样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。
• 样品的基底部应切割平整（以便于样品 粘贴），观察面应作好识别标记。
2020/3/31
2、清洗
（1）清洗的目的： 充分暴露样品观察面的表面特征。 （2）清洗液的选择 • 常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液； • 特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆
2020/3/31
3、固定
（1）固定的目的 • 保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状
态。 • 使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表
面张力变化的能力。 • 提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。 （2）常用的固定剂 • 戊二醛：常用浓度为1~4%。 • 锇酸：一般用1~2%浓度。 （3）固定的方法 • 先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清
取样
固定
脱水
醋酸异戊酯
(15~30 min或过夜）
样品入室 ( 0~10℃ )
注(入0~1液0℃体) CO2
置 换 气 化 放气取样
(15~20℃) (35~40℃) ( 35~40℃ ) (10~20 min) (5~10 min) (30 min)
2020/3/31
图3-4 临界点干燥过程
6、粘样（样品的粘贴）
水
70.61
2020/3/31
（2）脱水的方法 • PBS清洗3次，5~10min/ 次→ 乙醇梯度脱水
到纯乙醇，5~30min/级。 （3）脱水的要求 • 脱水要彻底； • 严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保
持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品 的皱缩、塌陷或变形。
2020/3/31
5、干燥
• 对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴 样品等导电处理，可减少充放电效 应的202影0/3/3响1 。
图1-4 血细胞充放电效应图例
2020/3/31
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2020/3/31
（二）扫描电镜的特点
• 观察表面形貌。 • 图象景深大，富有立体感。 • 放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数
1、游离细胞的制样方法
（1）将盖玻片洗净灭菌，样品面做标记； （2）将盖玻片垂直浸入热溶的2~5%明胶后即刻垂
直取出，用滤纸吸去边缘多余的明胶； （3）将盖玻片的样品面朝上平放在滤纸上，于
37℃干燥箱烘干后备用； （4）在盖玻片样品面上滴1~2滴细胞悬浮液，静置
20min左右，用滤纸吸去表面残存的悬浮液 。 （5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。 （2020/63/3）1 常规方法脱水、临界点干燥、粘样和镀膜。
盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织 等）的初级清洗。 （3）清洗的方法 • 浸泡清洗。 • 震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜 等），可利用震荡器进行震荡清洗。 • 离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。 （4）清洗的要求 • 样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净 ，以充分暴露表面特征。
多样品发生变形或收缩，故本法是 在缺乏其他条件下不得已采用的干 燥方法。
2020/3/31
（2）干燥的方法
2）真空干燥法 • 方法：在真空的条件下使样品中的脱水剂
挥发掉。 • 特点：效果与空气干燥时相同，仅是干燥
的速度较快。
2020/3/31
（2）干燥的方法
3）冷冻干燥法
图3-1 冷冻干燥法技术流程
• 组成：检测器（二次 电子探头）、光电倍 增管、视频放大器。
• 作用：对二次电子进 行收集、放大和处理 ，以调制显像管栅极 电压并成象。
2020/3/31
图1-1 扫描电镜工作原理图
（３）电子偏转系统（扫描系统 ）
• 组成：扫描发生器 、扫描线圈。
• 作用：使镜筒和显 像管内的电子束分 别进行同步光栅状 扫描，最后在显像 管的荧光屏上显示 出完整图象。
2020/3/31
图1-2 样品倾斜对二次电子产率的影响
2、影响图象形成的因素
（2）原子序数效应 • 原子序数效应：样品内原子序数不同的元
素，在图象上也会形成一定的亮度差异， 这种现象称为原子序数效应。 • 对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀 一层原子序数高的金属膜，可提高图象质 量。
2020/3/31
2020/3/31
2020/3/31
1、 SEM基本结构及其作用
（１）电子光学系统
电子枪：阴极、阳极、栅极。
阴极—通电加热后产生电子 束。
阳极—加速电子束。 栅极—控制和会聚电子束流 。
电磁透镜：会聚电子束，形
成直径5~10纳米的电子束（即电 子2020探/3/31针），照射于样品上 。
图1-1 扫描电镜工作原理图
（1）目的：将样品粘牢在样品台上。 （2）粘样材料 • 双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒
状的样品。 • 导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成
的 糊状物，用于粘贴基底部不平 整的样品。
2020/3/31
7、金属镀膜
在样品表面喷镀一层厚约3~30nm的金属薄膜 。
（1）镀膜的目的 ① 提高样品表面的导电性。 ② 提高二次电子发射率。 ③ 减少电子束对样品的损伤。
（2）镀膜材料的选择 金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。
（3）镀膜的方法
2020/3/31
7、金属镀膜
1）离子溅射法
① 离子溅射仪的主要结构
② 离子溅射镀膜的原理 • 辉光放电 → 离子溅射
→ 漫散射镀膜 ③ 镀膜厚度的控制：
溅射时间的选择
8、电镜观察
2020/3/31
图3-6 离子溅射仪及原理图
（二）特殊样品的常规制备方法
洗后，再用锇酸固定30~60分钟。
2020/3/31
4、脱水
（1）脱水的目的
用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙 醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使 样品在后续干燥处理时的表面张力减少。
表1 几种液体的表面张力 单位：达因/cm
液体
乙醇
丙酮
表面张力 16.49（20℃） 2 1.16（40℃）
(20℃）
• 特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面，
所以由表面张力引起的样品变形和损
伤大为减少，因此干燥效果较好。
•
缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。 2020/3/31
（2）干燥的方法
4）临界点干燥法
① 临界点干燥的原理（图3-2）
2020/3/31
图3-2 临界点干燥原理图
临界点干燥的原理之小结
• 临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定 的温度（临界温度）。
2、影响图象形成的因素
（3）充放电效应
• 充电：当初级电子轰击干燥的生物 样品表面时，会因其导电性能差而 发生电荷积累的充电现象，并对随 后到来的初级电子产生排斥，使电 子散开，且导致二次电子发射轨迹 偏斜或杂乱。
• 放电：轰击区内电子堆积，与邻近 区域间产生电位差，则可产生放电 打火现象。
• 充放电效应：上述充、放电状况造 成图象忽明忽暗或模糊不清等现象 ，称为充放电效应。
2020/3/31
Байду номын сангаас习题
1、扫描电镜的特点 2、临界点干燥的原理 3、金属镀膜的目的 4、 SEM样品的常规制备步骤 5、 SEM样品制备的基本要求与原则
2020/3/31
（1）干燥的目的 彻底去除样品中的脱水剂，使样品
干 燥，以保护镜筒高真空和样品不变
形。
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（2）干燥的方法
• 1）空气干燥法 • 2）真空干燥法 • 3）冷冻干燥法 • 4）临界点干燥法
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（2）干燥的方法
1）空气干燥法 • 方法：把样品放在空气中，让其中的脱水
剂自然挥发掉，以达到干燥的目的 。 • 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许
• 临界状态的特性：气、液密度相等，相界消失；液 体变成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加 多大的压力，气体不会变成液体。
• 临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除 的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。
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② 临界干燥液的选择——置换液与中间液
置换液：在临界点干燥器内起临界干燥 作用的液体称为置换液(表2)。
2020/3/31
图1-1 扫描电镜工作原理图
2、影响图象形成的因素
（1）倾斜角效应 —— 二次电子成像原理
• ∵ 二次电子产率主要取决于电 子束的入射角，而入射角又主 要取决于样品的倾斜程度。
• ∴ 样品的倾斜角效应是影响图 象反差的主要因素。
• ∴ SEM图象的反差主要是由样 品表面的凹凸状态决定的，越 是凸出的部位产生二次电子的 数量越多，图象越明亮，反之 则较暗。
2020/3/31
1、SEM样品的常规制备步骤 取材 →清洗 → 固定 → 清洗 → 脱水 → 中间液替代脱水剂 → 临界点干燥 → 粘样 → （金属）镀膜 → SEM观察
2、SEM样品制备的基本要求与原则 （1）样品观察面要处理干净，以充分暴露表 面特征； （2）保护样品观察面，以保持原状不变形； （3）样品要彻底干燥，以保护镜筒的高真空 和样品的形态结构； （4）样品要作导电处理，以减少充放电效应 和提高二次电子发射率。
（２）检测系统
①二次电子的来源及作用 • 在样品表面以下几纳米到几十纳米的区
域，被入射电子（初级电子、一次电子 ）所激发出来的样品原子中的外层电子 ，称谓二次电子（次级电子）。 • SEM通常是由二次电子所形成的图象来 显示生物样品的表面形貌。
2020/3/31
（２）检测系统
② 二次电子检测系统 的组成及作用
表2 某些液体的临界特性
名称
水 乙醇 氟里昂
临界温度(℃)
CO2 374 243
28.9
临界压力
218.5 63 38
(kg/中cm间2)液：醋酸异戊酯
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液体
31.5 72.8
③ 临界点干燥器的主要结构（图3-3 ）
2020/3/31
图3-3 HCP-2型临界点干燥器
④ 临界点干燥的操作程序
10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直 径，一般为5~10 nm。
• 可观察块状样品： 0.5~10cm3。 • 样品制备简单。 • 可结合元素分析。
2020/3/31
2020/3/31
2020/3/31
1、取样
• 取样部位要准确。 • 取样大小要适当：常为≤1cm3。 • 取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对
Techniques of Scanning Electron Microscope
一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术
（一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法
2020/3/31
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一、扫描电镜的基本结构 与成像原理
样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。
• 样品的基底部应切割平整（以便于样品 粘贴），观察面应作好识别标记。
2020/3/31
2、清洗
（1）清洗的目的： 充分暴露样品观察面的表面特征。 （2）清洗液的选择 • 常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液； • 特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆
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3、固定
（1）固定的目的 • 保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状
态。 • 使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表
面张力变化的能力。 • 提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。 （2）常用的固定剂 • 戊二醛：常用浓度为1~4%。 • 锇酸：一般用1~2%浓度。 （3）固定的方法 • 先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清
取样
固定
脱水
醋酸异戊酯
(15~30 min或过夜）
样品入室 ( 0~10℃ )
注(入0~1液0℃体) CO2
置 换 气 化 放气取样
(15~20℃) (35~40℃) ( 35~40℃ ) (10~20 min) (5~10 min) (30 min)
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图3-4 临界点干燥过程
6、粘样（样品的粘贴）
水
70.61
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（2）脱水的方法 • PBS清洗3次，5~10min/ 次→ 乙醇梯度脱水
到纯乙醇，5~30min/级。 （3）脱水的要求 • 脱水要彻底； • 严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保
持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品 的皱缩、塌陷或变形。
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5、干燥
• 对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴 样品等导电处理，可减少充放电效 应的202影0/3/3响1 。
图1-4 血细胞充放电效应图例
2020/3/31
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（二）扫描电镜的特点
• 观察表面形貌。 • 图象景深大，富有立体感。 • 放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数
1、游离细胞的制样方法
（1）将盖玻片洗净灭菌，样品面做标记； （2）将盖玻片垂直浸入热溶的2~5%明胶后即刻垂
直取出，用滤纸吸去边缘多余的明胶； （3）将盖玻片的样品面朝上平放在滤纸上，于
37℃干燥箱烘干后备用； （4）在盖玻片样品面上滴1~2滴细胞悬浮液，静置
20min左右，用滤纸吸去表面残存的悬浮液 。 （5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。 （2020/63/3）1 常规方法脱水、临界点干燥、粘样和镀膜。
盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织 等）的初级清洗。 （3）清洗的方法 • 浸泡清洗。 • 震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜 等），可利用震荡器进行震荡清洗。 • 离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。 （4）清洗的要求 • 样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净 ，以充分暴露表面特征。
多样品发生变形或收缩，故本法是 在缺乏其他条件下不得已采用的干 燥方法。
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（2）干燥的方法
2）真空干燥法 • 方法：在真空的条件下使样品中的脱水剂
挥发掉。 • 特点：效果与空气干燥时相同，仅是干燥
的速度较快。
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（2）干燥的方法
3）冷冻干燥法
图3-1 冷冻干燥法技术流程
• 组成：检测器（二次 电子探头）、光电倍 增管、视频放大器。
• 作用：对二次电子进 行收集、放大和处理 ，以调制显像管栅极 电压并成象。
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图1-1 扫描电镜工作原理图
（３）电子偏转系统（扫描系统 ）
• 组成：扫描发生器 、扫描线圈。
• 作用：使镜筒和显 像管内的电子束分 别进行同步光栅状 扫描，最后在显像 管的荧光屏上显示 出完整图象。
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图1-2 样品倾斜对二次电子产率的影响
2、影响图象形成的因素
（2）原子序数效应 • 原子序数效应：样品内原子序数不同的元
素，在图象上也会形成一定的亮度差异， 这种现象称为原子序数效应。 • 对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀 一层原子序数高的金属膜，可提高图象质 量。
2020/3/31
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2020/3/31
1、 SEM基本结构及其作用
（１）电子光学系统
电子枪：阴极、阳极、栅极。
阴极—通电加热后产生电子 束。
阳极—加速电子束。 栅极—控制和会聚电子束流 。
电磁透镜：会聚电子束，形
成直径5~10纳米的电子束（即电 子2020探/3/31针），照射于样品上 。
图1-1 扫描电镜工作原理图
（1）目的：将样品粘牢在样品台上。 （2）粘样材料 • 双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒
状的样品。 • 导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成
的 糊状物，用于粘贴基底部不平 整的样品。
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7、金属镀膜
在样品表面喷镀一层厚约3~30nm的金属薄膜 。
（1）镀膜的目的 ① 提高样品表面的导电性。 ② 提高二次电子发射率。 ③ 减少电子束对样品的损伤。
（2）镀膜材料的选择 金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。
（3）镀膜的方法
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7、金属镀膜
1）离子溅射法
① 离子溅射仪的主要结构
② 离子溅射镀膜的原理 • 辉光放电 → 离子溅射
→ 漫散射镀膜 ③ 镀膜厚度的控制：
溅射时间的选择
8、电镜观察
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图3-6 离子溅射仪及原理图
（二）特殊样品的常规制备方法
洗后，再用锇酸固定30~60分钟。
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4、脱水
（1）脱水的目的
用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙 醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使 样品在后续干燥处理时的表面张力减少。
表1 几种液体的表面张力 单位：达因/cm
液体
乙醇
丙酮
表面张力 16.49（20℃） 2 1.16（40℃）
(20℃）
• 特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面，
所以由表面张力引起的样品变形和损
伤大为减少，因此干燥效果较好。
•
缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。 2020/3/31
（2）干燥的方法
4）临界点干燥法
① 临界点干燥的原理（图3-2）
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图3-2 临界点干燥原理图
临界点干燥的原理之小结
• 临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定 的温度（临界温度）。
2、影响图象形成的因素
（3）充放电效应
• 充电：当初级电子轰击干燥的生物 样品表面时，会因其导电性能差而 发生电荷积累的充电现象，并对随 后到来的初级电子产生排斥，使电 子散开，且导致二次电子发射轨迹 偏斜或杂乱。
• 放电：轰击区内电子堆积，与邻近 区域间产生电位差，则可产生放电 打火现象。
• 充放电效应：上述充、放电状况造 成图象忽明忽暗或模糊不清等现象 ，称为充放电效应。
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1、扫描电镜的特点 2、临界点干燥的原理 3、金属镀膜的目的 4、 SEM样品的常规制备步骤 5、 SEM样品制备的基本要求与原则
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（1）干燥的目的 彻底去除样品中的脱水剂，使样品
干 燥，以保护镜筒高真空和样品不变
形。
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（2）干燥的方法
• 1）空气干燥法 • 2）真空干燥法 • 3）冷冻干燥法 • 4）临界点干燥法
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（2）干燥的方法
1）空气干燥法 • 方法：把样品放在空气中，让其中的脱水
剂自然挥发掉，以达到干燥的目的 。 • 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许
• 临界状态的特性：气、液密度相等，相界消失；液 体变成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加 多大的压力，气体不会变成液体。
• 临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除 的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。
2020/3/31
② 临界干燥液的选择——置换液与中间液
置换液：在临界点干燥器内起临界干燥 作用的液体称为置换液(表2)。
2020/3/31
图1-1 扫描电镜工作原理图
2、影响图象形成的因素
（1）倾斜角效应 —— 二次电子成像原理
• ∵ 二次电子产率主要取决于电 子束的入射角，而入射角又主 要取决于样品的倾斜程度。
• ∴ 样品的倾斜角效应是影响图 象反差的主要因素。
• ∴ SEM图象的反差主要是由样 品表面的凹凸状态决定的，越 是凸出的部位产生二次电子的 数量越多，图象越明亮，反之 则较暗。
2020/3/31
1、SEM样品的常规制备步骤 取材 →清洗 → 固定 → 清洗 → 脱水 → 中间液替代脱水剂 → 临界点干燥 → 粘样 → （金属）镀膜 → SEM观察
2、SEM样品制备的基本要求与原则 （1）样品观察面要处理干净，以充分暴露表 面特征； （2）保护样品观察面，以保持原状不变形； （3）样品要彻底干燥，以保护镜筒的高真空 和样品的形态结构； （4）样品要作导电处理，以减少充放电效应 和提高二次电子发射率。
（２）检测系统
①二次电子的来源及作用 • 在样品表面以下几纳米到几十纳米的区
域，被入射电子（初级电子、一次电子 ）所激发出来的样品原子中的外层电子 ，称谓二次电子（次级电子）。 • SEM通常是由二次电子所形成的图象来 显示生物样品的表面形貌。
2020/3/31
（２）检测系统
② 二次电子检测系统 的组成及作用
表2 某些液体的临界特性
名称
水 乙醇 氟里昂
临界温度(℃)
CO2 374 243
28.9
临界压力
218.5 63 38
(kg/中cm间2)液：醋酸异戊酯
2020/3/31
液体
31.5 72.8
③ 临界点干燥器的主要结构（图3-3 ）
2020/3/31
图3-3 HCP-2型临界点干燥器
④ 临界点干燥的操作程序
10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直 径，一般为5~10 nm。
• 可观察块状样品： 0.5~10cm3。 • 样品制备简单。 • 可结合元素分析。
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1、取样
• 取样部位要准确。 • 取样大小要适当：常为≤1cm3。 • 取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对