基因工程酶学基础幻灯片

可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。
如Not I （GCGGCCGC）
某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并 非严格专一。
如Hind Ⅱ可识别不止一种核苷酸序列：
5’- GTYRAC -3’
Y: C或T
R: A 或G
GTCGAC 和 GTTAAC
Hind Ⅱ可识别几种核苷酸序列？
II类限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分 离
（第1一）个识酶别是位H点in序d列Ⅱ，其次是 Hind III。
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）, 与DNA的来源无关。 （2）切割位点
识别位点处切开双链DNA。形成粘性末端或平齐末端 （3）粘性末端
EcoR I 5’-G A A T T C-3’ 5’端凸出 3’-C T T A A G-5’ EcoR V 5’-G A T A T C-3’
3’-C T A T A G-5’
Pst I 5’-C T G C A G-3’
3’-G A C G T C-5’ 3’端凸出
III类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA（一般在识别位点24-26bp） ，但反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。
限制-修饰系统
早在上世纪60年代Linn和Arber在研究噬菌体的寄主范围时 发现如下的现象：
分别在E. coli的K菌株和B菌株上生长的λ噬菌体（称λK和 λ B ）能高效感染各自的宿主;
但用λK感染B菌株或用λ B 去感染K菌株则感染率会大大降 低，这就是限制。
如果一旦λK感染B菌株成功则在B菌株中形成的后代也就能 高效感染B菌株，再也没有限制现象， 这个现象称为修饰。
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优选第二章基因工程酶学基础
工具酶
在生物技术中能用于DNA和RNA分子的切割、连 接、聚合、反转录及其它修饰等有关的各种酶 系统称为工具酶。
酶是DNA重组技术中必不可少的工具。
核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类
核酸内切酶
核酸外切酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
来源 主要来源于原核生物
据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计，仅Ⅱ 型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了 2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。
功能 自我保护作用
研究发现，细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切 断，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰 而得以保护，一起构成限制-修饰系统。
1.限制性内切核酸酶的类型
现已从各种微生物中发现与鉴定出3800余种限制-修饰系 统，其中有限制性内切核酸酶3819个、甲基转移酶844个。 现已商品化的限制酶624个，甲基转移酶32个。
Ⅰ 型限制性内切酶（90个） Ⅱ 型限制性内切酶（3714个） Ⅲ 型限制性内切酶 （12个）
I 型限制性内切酶
为M。如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的
甲基化酶。实际应用中，R常被省略。
3. Ⅱ型限制性内切酶的基本特性
1）识别序列的特异性 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（4-6 bp，多数 是呈典型的旋转对称型的回文结构）。
与DNA的来源无关，即没有种的特异性。
稀有切割限制性内切核酸酶（rare cutter）
2）将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位
于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体
外遗传成分。
如Hind Ⅱ：d菌株
EcoR I ：抗药性R质粒
3）如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马
字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。
4）还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶
限制和修饰是由宿主控制的，故称为宿主控制的限制和修饰 作用。
限制
限制性内切酶将 侵入细菌体内的外 源DNA切成小片断。
修饰
细菌自身的DNA碱基被甲基化 酶修饰所保护，不能被自身的 限制性内切酶识别切割。
①Dam甲基化酶：GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ②Dcm甲基化酶：CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置引入甲 基
2）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能
Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。
它们识别相同的DNA序列，但功能不同。功能有何不同？
如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶
主要工具酶
• 第一节 • 第二节 • 第三节 • 第四节
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶和反转录酶 DNA 修饰酶
源自文库 第一节 限制性核酸内切酶
核酸酶：
通过切割两相邻核苷酸残基间的磷酸二酯键，使核 酸分子的多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。
核糖核酸酶 RNase：专门水解断裂RNA分子
脱氧核糖核酸酶 DNase：特异水解断裂DNA分子
核酸外切酶 exonuclease：从核酸分子末端开始， 一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链
核酸内切酶 endonuclease：从核酸分子内部切割磷 酸二酯键使之断裂形成小片段
限制性内切酶 Restriction enzymes (分子手术刀)
在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链打开。 识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA 分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。
1968年首先由M.Meselson和R.Yuan在从大肠杆菌B株和K株分离
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列
EcoB： TGA(N)8TGCT
（2）切割位点
EcoK：AAC(N)6GTGC
在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链
（3）作用条件
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）
EcoP1: AGACC—— EcoP15: CAGCAG——
在基因工程操作中用途不大
2.限制性内切核酸酶的命名 （EcoR I、Hind Ⅲ）
1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母，构成酶的基本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；
流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。