农杆菌介导的水稻转化
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化一．愈伤组织的培养1.愈伤组织的诱导成熟水稻种子去壳，用70%酒精处理2min，无菌水冲洗2~3次，再用25%次氯酸钠消毒处理15min，无菌水冲洗5~6次，将种子转到灭菌的培养皿上，于超净工作台上吹干。
接种到诱导培养基N6AD2.5上，28℃暗培养至长出愈伤组织（10 d左右）。
2.继代培养用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上，28℃暗培养10 d。
继代培养两次后待用。
二．农杆菌的转化及培养1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化，并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中，加入2.5uL pHB质粒，冰浴30min，电击，向电击杯中加入800uL SOC 混匀，将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm，振荡培养2h，13000rpm离心5min，去掉大部分上清液，用200uL枪头吹打悬浮，涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上，28℃培养至长出菌落。
2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5，5000rpm离心5min收集细胞，用N6A CO液体培养基重悬。
三．浸染与共培养1.选择生长状态良好的愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡，一般浸染时间为10~30min，浸染时要不是摇动。
2.倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。
3.将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6A CO固体培养基上，26℃暗培养2~3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
四．脱菌与筛选1.共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈；2.浸泡于含500mg/L Cef 的N6A CO液体培养基中，在摇床上中速振荡30~60min；3.弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上，26℃暗培养3周，再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。
其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。
1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。
转基因水稻培育实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将具有特定功能的基因导入水稻中，培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供新的途径。
二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入目标生物体基因组中，使目标生物体获得新的性状或功能。
本实验采用农杆菌介导法将目的基因导入水稻中，通过基因重组，使水稻获得抗病、抗虫、抗逆等优良性状。
三、实验材料1. 水稻品种：Oryza sativa L.（籼稻）2. 抗病基因：Xa213. 抗虫基因：Bt蛋白基因4. 抗逆基因：海藻糖合成酶基因5. 农杆菌：Agrobacterium tumefaciens EHA1056. 实验试剂：限制酶、DNA连接酶、质粒、抗生素等四、实验方法1. 目的基因的克隆与构建（1）从基因库中获取抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的DNA序列。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
（3）将扩增的目的基因与载体质粒连接，构建重组质粒。
2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化农杆菌EHA105。
（2）将转化后的农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，筛选阳性克隆。
3. 转化水稻（1）将阳性农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
（2）将农杆菌与水稻叶片接触，进行转化。
4. 筛选转基因植株（1）将转化后的水稻苗移栽至田间，进行抗性鉴定。
（2）根据抗性表现，筛选出转基因植株。
5. 分子鉴定（1）提取转基因植株的DNA。
（2）利用PCR技术检测目的基因是否整合到水稻基因组中。
五、实验结果1. 成功构建了含有抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的重组质粒。
2. 转化后的农杆菌能够将目的基因导入水稻中。
3. 通过抗性鉴定，筛选出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻。
4. 分子鉴定结果显示，目的基因已整合到水稻基因组中。
六、实验结论本实验成功培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供了新的途径。
《农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻EIS基因转化研究》
《农杆菌介导甜高粱Bar基因再生体系建立及水稻EIS基因转化研究》一、引言近年来，基因工程技术已经广泛应用于植物遗传改良和农业生物技术领域。
其中，农杆菌介导的基因转化技术因其高效、便捷的特点备受关注。
本文旨在研究农杆菌介导的甜高粱Bar基因再生体系的建立，以及在水稻中转化EIS基因的研究。
这些研究对于提高作物的抗逆性、抗病性以及产量等具有重要意义。
二、材料与方法1. 材料本实验选用的植物材料为甜高粱和水稻。
所使用的农杆菌菌株为LBA4404，并含有Bar基因和EIS基因的重组质粒。
2. 方法（1）甜高粱Bar基因再生体系的建立首先，将LBA4404菌株与甜高粱叶片进行共培养，以实现基因的转移。
然后，通过筛选培养基对转化后的细胞进行筛选，获得转基因植株。
最后，对转基因植株进行PCR检测和Southern杂交验证，以确认Bar基因的成功整合。
（2）水稻EIS基因转化研究采用类似的方法，将含有EIS基因的重组质粒导入水稻愈伤组织中。
通过观察愈伤组织的生长情况、PCR检测和RT-PCR分析等方法，评估EIS基因在水稻中的表达情况。
三、实验结果1. 甜高粱Bar基因再生体系的建立通过农杆菌介导法，成功将Bar基因导入甜高粱中。
经过筛选培养基的筛选，获得了转基因植株。
PCR检测和Southern杂交验证结果表明，Bar基因已成功整合到甜高粱基因组中。
此外，转基因植株的抗性实验表明，其抗除草剂的能力明显提高。
2. 水稻EIS基因转化研究将EIS基因导入水稻愈伤组织后，观察到愈伤组织的生长情况与对照组相比有所改善。
PCR检测结果显示，EIS基因已成功导入水稻中。
RT-PCR分析表明，EIS基因在转基因水稻中的表达水平较高。
此外，进一步的研究表明，EIS基因的表达对提高水稻的抗逆性和产量具有积极影响。
四、讨论本研究建立了农杆菌介导的甜高粱Bar基因再生体系，成功将Bar基因导入甜高粱中，并实现了Bar基因的成功整合和表达。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展
基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。
作者简介陈思（1997—），女，安徽安庆人，助理农艺师，从事水稻遗传育种工作。
*通信作者收稿日期2022-06-17农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展陈思张从合*王慧吴浩然杨力黄艳玲管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA 结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。
本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。
关键词水稻；根癌农杆菌；农杆菌介导转化法；遗传转化中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0001-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.001开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Influencing Factors of Agrobacterium-mediated GeneticTransformation of Rice and Its ApplicationCHEN SiZHANG Conghe *WANG HuiWU HaoranYANG LiHUANG YanlingGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice genetic transformation,agrobacterium-mediated transformation method has manyadvantages compared with other methods,such as the complete structure and relatively stable expression of the transferred exogenous DNA,simple operation and high transformation rate.It has been widely used in transgenic technology.This paper reviewed the principles of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens and the factorsaffecting genetic transformation,and discussed the application prospects of agrobacterium-mediated methods.Keywordsrice;Agrobacterium tumefaciens ;agrobacterium mediated transformation method;genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全球1/2以上人口的主食，也已经成为植物基因组学研究的重要对象[1]。
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
农杆菌介导水稻转基因技术的原理与运用分析
·29·所谓的转基因技术实际上是DNA 技术的重组方式，从外源克隆到的优良基因直接地注入到植物体的基因组织当中来，对作物的遗传性特征进行改变，使其向着人类更加向往的发展方向。
转基因技术自从问世以来实现了非常快速的发展，目前全球种植转基因的作物越来越多。
农杆菌介导是转基因技术之一，其在水稻转基因当中的应用，采取的是外源基因转化的方式，使外源基因的转化更具更正性，降其为稳定性等，进而实现大片段的基因转换等。
近年来水稻转基因技术不断地发展，并取得了相当大的成效，其中农杆菌介导水稻转基因技术发胡了重要的作用，以下降低基本的原理以及运用情况进行重点分析。
1.基本原理农杆菌介导是一种天热性的基因转化系统。
在具体的划分过程中可以分诶根瘤农杆菌和发根农杆菌。
首先，根瘤农杆菌当中有一种肿瘤诱导颗粒，这种颗粒具有可转移性的DNA 以及毒性区和冠瘿碱代谢基因。
在T -DNA 的两端是在两个数为25bp 的重复性序列，分别位于左右两个边界当中，两个边界的序列之间又是生长素和细胞分裂素合成的共性基因以及冠瘿碱合成性基因。
不同的区域内存在多个基因段，每一个基因段当中又有非常多基因。
一旦植物出现被伤害的情况，就会分泌出具有酚类化合物的一种汁液，此种汁液是通过染色体的毒性基因等介导㢟进行传输的，从而使农杆菌可以向只的其他部位上进行移动，并附着在其表面之上。
在T -DNA的转移上两个边界序列与之关系非常密切，特别是右侧的边界对于T -DNA 的精准转移是必不可少的重要条件，而且在边界序列之间也存在着一定的基因，但这些基因对于T -DNA 的转移并不发生太大的影响。
因此，T -DNA 区域的基因是可以采取外源性基金进行替代的，之后再利用农杆菌将已经改造后的T -DNA 转移到植物的基因组织当中，进而获取到转基因的植株。
伴随着科学技术水平的不断提升，农杆菌转化也进入到了非常关键的阶段，人们对此进行了多次地改造，并使其载体不断地创新与完善，转化的效率不断地提升，这样应用的范围也会越来越广泛。
水稻转基因技术的研究与应用
水稻转基因技术的研究与应用水稻是我国的主要粮食作物之一，也是全球最重要的粮食作物之一。
随着社会和经济的不断发展，人们对水稻品质和产量的要求也不断提高。
而转基因技术作为一种创新性技术，为水稻的改良提供了新的途径。
本篇文章将探讨水稻转基因技术的研究与应用。
一、水稻转基因技术的研究1.背景水稻转基因技术是将外源基因导入水稻细胞中，使水稻获得某些特定基因的性状。
这样可以通过调整水稻的生长和发育，使其在抗病、耐旱、提高产量等方面得到改善。
2.研究方法水稻转基因技术主要包括以下三种方法：(1) 农杆菌介导转化：将所需基因导入农杆菌载体，经过处理后将其导入水稻细胞中，使细胞产生抗病、提高产量等性状。
(2) 基因枪法转化：将所需基因载入金属小粒子上，压缩空气将粒子“射”入水稻细胞中。
(3) 电穿孔法转化：利用电场作用使水稻细胞短暂性开放，使基因能够有效导入细胞中。
3.研究进展目前，水稻转基因技术已取得了一些重要的进展，主要体现在以下几个方面：(1) 抗虫基因的成功导入：2007年，我国科学家成功将抗虫基因导入水稻，并以此培育了多个抗虫水稻品种。
(2) 抗病基因的成功导入：我国科学家通过细胞融合技术，将米瘟抗病基因导入一种水稻品种中，并获得了抵御米瘟病的水稻品种。
(3) 抗旱基因的成功导入：我国科学家成功将抗旱基因导入水稻，良种生长在干旱条件下的产量大大提高。
二、水稻转基因技术的应用1. 抗虫作物的生产目前，我国已经培育了多个抗虫作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交，产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐虫。
2. 抗病作物的生产目前，我国已经获得了多个抗病作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交，产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐病。
3. 提高产量基因工程水稻的生产方式与传统水稻生产方式相比，具有很大的优势。
通过导入相关基因，可以提高水稻的产量，并缩短生长周期。
4. 改善品质基因工程水稻的应用还可以改善水稻品质，如改良失酬水稻的品质和味道等。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选
浙江大学硕士学位论文农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选姓名：刘朋娟申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王政逸20050501本研究受国家自然科学基金项目３０２７０８６１资助单位代码：——究生学号：——硕士学位论文农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选论文评阅人：．郄鏖压潘废垡蒸友基答辩委员会主席：．郑康乐答辩委员会成员：奎蕉夔筮回盐国昌三遮逸论文答辩日期：摘要稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）可以引起水稻上的重要病害一稻瘟病。
了解彪ｇｒｉｓｅａ的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义，而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。
分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因，是达到这一目标的关键所在。
ＢＮＡ插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一，ＡＴＭＴ是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术，具有转化效率离、成本低，操作方便和重复性好多重优点。
我们在构建了二个含有潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因双元载体的基础上，成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化，转化效率达每１０６个分生孢子＞３００个转化子，并得到了４０００多个转化子。
通过继代培养和ＰＣＲ检测，证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明，大约有２／３转化子的Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。
用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性，发现一个致病缺陷突变体：Ａ１－４１２。
该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片，说明Ａ１．４１２突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。
进一步的表型分析，发现Ａ１，４１２突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的７％，在疏水表面不能形成附着胞，部分分生孢子萌发的速度也略有延迟。
Ｓｏｕｔｈｃｍ杂交显示Ａ１－４１２基因组中Ｔ－ＤＮＡ插入是单拷贝的。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤第⼀部分：农杆菌介导转化⽔稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗⽣素，LBA4404:Rif或Str；EHA 105：Rif或Str；GV3103：庆⼤霉素。
如果不加抗⽣素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗⽣素浓度为：50µg/m l。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养⾄OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离⼼管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离⼼30s，弃去上清液；4）沉淀⽤1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离⼼30s，弃去上清液；6）每管⽤100µl 20mMCaCl2悬浮，⽤于转化；制备好的感受态细胞可马上使⽤，也可按每管200ul分装于⽆菌离⼼管中，于4℃保存48⼩时内使⽤，长期贮存时必须在液氮中速冻后转⼀70℃保存。
使⽤时从⼀70℃取出，置冰上融化后使⽤。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50µl农杆菌感受态细胞中加⼊质粒DNA 0.1～1µg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放⼊液氮中5min（或1min），然后⽴即放⼊37℃⽔浴锅中⽔浴5min；3）取出离⼼管，加⼊0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗⽣素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗⽣素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）⼩量提取质粒DNA，加GTE同时加5µL溶菌酶（50µg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌介导法转化宁夏水稻的研究
鲜亮的淡黄色颗粒状愈伤组织 ，预培养基中培 养 ５ ｄ后作为带有
目的基农杆菌侵染 的受体。
２ ）供体菌株 的培养
Ｉ 材 料 与方 法
１１ 供 试材 料 ．
１１ ．１ 水稻 材 料 ．
以水稻成熟胚诱导的愈 伤组织作为农杆菌介导的受体材料。 供试材料优育 ２ ８由宁夏农科院农作物研究所水稻 室提 供 ，该材
为 ０６ ０８ ．￣ ．；以 １％～ ２％的比例将摇好 的菌液转接于 ４ ｍ ０ Ｌ新鲜
且无抗生素的 Ｌ Ｂ液体培养基 中，８ｃ ２ ０ｐ ｍ恒温摇床 上继续 ２ ｃ 、 ２ ｒｐ 振荡培养至 Ｏ ６ ０为 Ｏ６ Ｏ８时即可 。 Ｄ０ ．～ ． ３ ）侵 染 在超净工作台上将经预培养的愈伤组织转入 无菌 烧杯 中， 倒入 已培养好 的农杆菌液 ， 并不 断摇动 ， 外植体 与农杆 使 菌充分接 触 ， 浸泡时 间为 ２ ｍｎ 将愈伤组 织取 出后 ， ５ ｉ； 用无菌 滤纸
３ 中国科 学院上海植物生理研究所。 ． 上海 摘 ２ ０ ３ ００２
要： 通过对 Ｈ Ｌ 抗盐基 因农杆菌介 导法转化 宁夏水稻的研 究 ， Ａ １ 建立起 了以优 育 ２ ８成熟胚诱 导的愈伤组织为
转化受体的农杆菌介导法转化体 系， 为宁夏水稻遗传转化研究奠定了基础。
关键 词 ： 水稻 ；农杆 菌介导法 ；遗传转化 中 图 分类 号 ：５ １ ＋ ｓ １． ２ ２ 文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ：０２ ２ ４ ２ ０ ） １ ００ — ３ １０ — ０ Ｘ（０ ９ ０ — ０ １ ０
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农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
4.转入无菌离心管，5000rpm离心5分钟,去上清液。
5.加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20分钟后，4℃，5000rpm离心5分钟，去上清。
6.加入4ml预冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30分钟，-70℃放置3分钟，42℃水浴1-2分钟，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培2-3小时后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上，28℃培养。
1.3农杆菌转化子的PCR鉴定将农杆菌转化子，用PCR方法鉴定是否正确转进EHA105中。
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16小时，直接用菌液做PCR。
PCR所用的引物为pCAMBIA1301载体上特异性的引物FP35S：5’-TAC GCA CAA TCC CAC TAT CCT T-3’，RP GUS：5’-CTG ATG CTC CAT CAC TTC CTG A-3’。
PCR反应参数设置：94℃预变性3分钟后开始以下循环反应：94℃变性30秒，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃继续延伸10分钟，反应结束后，取20μl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。
PCR反应体系母液浓度体积终浓度农杆菌转化子菌液体2μlP1 2μM 2μl200nMP2 2μM2μl200nM10×PCR Buffer 2μlMg2+25mM 1.2μl 1.5mMdNTP 2.5mM 1.2μl150μMTaq酶5U/μl0.2μl1UH2O 9.4μl终体积20μl2. 根癌农杆菌介导的水稻转化2.1. 水稻转化受体的准备2.1.1. 水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟进行表面灭菌，灭菌时要经常搅拌。
用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。
在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
2.1.2. 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。
约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。
以后每两周继代培养一次。
挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。
2.2. 农杆菌的培养将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线,28℃黑暗培养2-3天,用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5,加入AS，使AS终浓度为100mΜ,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
2.3. 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养挑选状态较好（继代培养5-7天、色泽淡黄）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可),室温放置20分钟,并不时晃动。
倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。
2.4. 抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。
大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
2.5. 抗性愈伤组织的分化从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。
30-40天后进一步分化出小苗。
2.6. 生根、壮苗和移栽当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。
选择高约10cm、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。
水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。
培养基诱导培养基MS（籼稻）/N6（粳稻）大量+ MS-Fe盐+ B5微量+ B5有机+ 2,4-D 2.5 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖30g/l + Gelrite 2.6 mg/l pH 5.8继代培养基同诱导培养基，但是2,4-D浓度改为2.0mg/L共培养（固体）培养基MS（籼稻）/N6（粳稻）大量+ MS-Fe盐+ B5微量+ B5有机+ 2,4-D 2.0mg/L + CH 500mg/l + 肌醇2000 mg/L + AS 100μM + 麦芽糖/ 蔗糖30g/l + Gelrite 2.6g/l pH 5.5(液体选择培养基无Gelrite)选择培养基MS（籼稻）/N6（粳稻）大量+ MS-Fe盐+ B5微量+ B5有机+ 2,4-D 2.0 mg/L + proline 500 mg/l +glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖30g/l + Gelrite 2.6 g/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8分化培养基MS（籼稻）/N6（粳稻）大量+ MS-Fe盐+ B5微量+ B5有机+ NAA 0.1 mg/L + KT 4 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖30g/l + Gelrite 2.6 g/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8生根培养基1/2 MS/N6大量+ MS-Fe盐+ B5微量+ 蔗糖30g/l + Agar 0.8% pHBasic培养基N6（大量）50ml （20倍）Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/LB5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/LB5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/Lproline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)KNO32830mg/L 56.6g/L MgSO4.7H2O 185 mg/L 3.7 g/L (NH4)2SO4463 mg/L 9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/LKH2PO4400 mg/L 8.00 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.2 MgSO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.3 CaCl2.2H2O的配制同MgSO4.7H2O4 配好后放于棕色瓶4℃保存MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)KNO31900 mg/L 38g/L MgSO4.7H2O 370 mg/L 7.4 g/L NH4NO3 1650 mg/L 33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L 8.8 g/L KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L制备1 KNO3, NH4NO3, MgSO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,3 CaCl2.2H2O同KH2PO44 配好后放于棕色瓶4℃保存MS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)终浓度母液(100倍)FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度母液(100倍) 肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l 0.1g/l pyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L 1 g/l棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/L Na2MnO4.2H2O 0.25mg/LCuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.配好后4℃保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存YM脓杆菌培养基KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine 2g/LNaCl 0.2g/L MgSO40.2g/L Yeast extract 0.3g/LAgar 15g/L PH=7.0。