人类染色体标本的制备及G显带核型分析

[作业与思考题]


1.简述人类染色体制备的操作过程和基本原理。 2.总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意 事项。 3.制作人的G显带正常核型配对分析图。

(三) G显带的核型分析



1.选取染色体分散良好、长度适中染色体G显带核型 照片，首先进行计数，然后将每条染色体剪下。 2.配对：同源染色体形态相同，带型一样；非同源染 色体的大小，形态等带型各异，根据这个原理，按照 染色体的大小、形态、着丝粒的位臵，随体的有无和G 显带带型等特征将46条染色体配成23对。 3.染色体排列：将配成23对的染色体按大小次序排列， 一对性染色体排在最后，并把排列好的23对染色体分 组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正 常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成 46,XX或46,XY。

染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条 染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、 宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定 的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是 将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨 （Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便，重 复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。 核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体， 并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每 一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。 染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在 临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断 及研究中具有重要意义。
2
显带染色体： 用特殊的染色方法使 染色体沿其长轴显示 出明暗交替或染色深 浅不同的横纹——带。 q
1 1
2
4
3
4
5 1 2 1 23 4
正常人体细胞染色体带型模式图
[实验用品]



1．器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温 培养箱、恒温水浴锅、10 ml刻度离心管、低 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。 2．材料：人外周静脉血。 3．试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、植 物血凝素（PHA）、秋水仙素(20μg/ml)、 0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、 固定液（甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、 Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液。
[注意事项]


1. 染色体标本制备中的关键因素包括秋水仙素的用量 和作用时间、低渗和固定的处理。其中低渗时间很重要， 处理时间过长则细胞膜过早破裂导致染色体丢失，处理 时间不足则致染色体分散不好，不利于计数分析。 2. G显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、 温度、pH等。其中胰蛋白酶溶液应37℃充分预热，溶液 pH应维持在6.8～7.2，以保证酶活性的发挥。另外消化 要适度，消化不足则带纹不清晰或不显示，消化过度则 带纹模糊甚至损失。
人类染色体标本的制备 及G显带核型分析
安徽医科大学基础医学院生物学教研室
[目的和要求]
1. 掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。 2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带 染色体的核型分析技术。
[实验原理]
源自文库
染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分 裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、 外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简 便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水 仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的 聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停滞在中 期时相，此时染色体具有最典型的形态），再经低渗、 固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析。
(二)人类染色体的G显带 【实验方法和步骤】
1.胰蛋白酶准备：在盛有45 ml 0.85%生理盐水的染缸 中加3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，调节pH值至6.8～ 1、预处理：实验前 3---4小时，取健康小鼠，每只 7.2，臵37℃恒温水浴锅中预温。 腹腔注射0．01％ 秋水仙素0．3-- 2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰蛋 0．4ml2 。注意不要伤及内脏。 白酶溶液中处理 ～3 min，不断轻摇载玻片以保证 2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠 作用均匀充分。 的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用 3.漂洗：迅速用0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶 的作用。 力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪 刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股 4.染色：用吉姆萨工作液染色10～15 min。 骨，剔除上面的肌肉，洗净。 5.冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电 吹风吹干。 6.镜检：光学显微镜下观察分析核型。
正常男性染色体G-显带核型
人类染色体G-显带特征口诀：
一秃二蛇三蝶飘 六号是个小白脸 十号长臂近带好 十三四十五 十六q2缢痕大 十八人小肚皮大 二十头重又脚轻 二十二头带小黑帽
四鞭炮五黑腰 七上八下九苗条 十一低来十二高 下、中、上 十七长臂带脚镣 十九一点腰 二十一象个葫芦瓢 X一担挑，Y是黑脚










6. 低渗 弃上清。加入37℃预温的0.075 mol/L氯化钾 8 ml，吸管轻轻吹打混匀，37℃低渗处理20 min。 7. 预固定 加入1ml 新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸 =3:1），轻轻混匀，1800 rpm 离心6 min。 8. 固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8 ml，轻轻混 匀，室温下静臵固定20 min。 9. 弃上清，重复固定1次。 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定 液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 11.制片：取上述悬液1～2滴，滴至沾有冰水或干燥的 洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 12.37℃温箱放臵3～4天或70℃烘烤2 h进行老化处 理，以备显带分析用。


基因组与核型 基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的 基因组(genome)，它代表了一个生物体染色体中储 存的全部遗传信息。 人类体细胞的正常核型
组 染色体号
1 2 3
主要特征
中央着丝粒染色体 亚中着丝粒染色体
大
A组 B组
4 ———— 5 6 ———— 12、X 13 ———— 15 17 16 18
亚中着丝粒染色体、无随体 亚中着丝粒染色体 近端着丝粒染色体、有随体
中央着丝粒染色体 亚中着丝粒染色体
C组
D组 E组 F组
19 ———— 20
21———— 22、Y
中央着丝粒染色体
近端着丝粒染色体、有随体 Y染色体略大、长臂平行伸展、无随体
小
G组
6
正常男性：46，XY 正常女性：46，XX
p
3
54 3 2 1 2 1 3 21 1 2 1 2 3
[实验步骤]


(一)人类外周血染色体标本的制备
1．采集人外周静脉血1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。 2. 超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中，每 瓶加0.3～0.5 ml全血。轻轻混匀。 3. 37℃恒温培养箱静臵培养72 h左右（培养24 h后水平 轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。 4. 培养至68～72 h（即终止培养前2～4 h），每瓶加秋 水仙素(20 μg/ml)至终浓度0.1～0.2 μg/ml，轻摇 培养瓶混匀，继续培养2～4 h。 5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10 ml玻璃离 心管，配平，1800 rpm 离心6 min。