蔗糖酶提取方法的研究

&" +" )" 4" 6"
!"" !"" !"" !"" !""
+!3& 4&3% 8&3! !&634 %"834
!
!#%
结果与讨论
细胞破碎
测定结果显示，一号样品与二号样品 酶 活 相 差
&
结论
综合上述实验结果，从酵母泥中 提 取 蔗 糖 酶 的
最佳条件是反复冰融法研磨酵母泥 &7 ，然后在 +), 热水浴中通过沉淀除去杂蛋白，再用 )"5 乙醇沉淀 蔗糖酶， 最后制得成品酶。
&" !3+%8
+" "364!
)" "3+%4
4" "3&4+
6" "3%94
!3&3&
醇提
按表 ! 所示配比表，分别采用 &"5 、
乙醇提取后沉淀重量
沉淀蔗糖酶。离心 +"5 、 )"5 、 4"5 、 6"5 浓度的乙醇， 后取管中的上清液测定其活性，并用精确电子天平 称取沉淀量。 表! 乙醇浓度配比表 混合液乙醇体积百分比（ 5） 酶液体积（ #$ ） 乙醇体积（ #$ ）
不大，但二号样品由于甲苯的存在给离心后上清液 的收集带来了不便， 并且如果去除不净， 会对后续工 作产生影响。三号样品效果较好， 其原因一是在冷冻 过程中会促使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加 细胞的亲水性能； 二是反复冷冻使细胞内形成冰晶， 引起细胞膨胀而破裂。另外由于每 隔 &"#’( 冰 冻 一 次， 整个提取过程保持较低温度， 酶失活率较低。
% 材料与方法
%#% 材料与仪器
收稿日期： #$$%*%#*%. 作者简介：孙国志（ ， 男， 助教， 研究方向： 生化工程及天然产 &()*+ ） 物的研究与开发。
’$
!!" !!" !!" !!" !!" !!" !!" !!" !!" !!"
孙国志 冯惠勇
摘 要 介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的方法。通过试验确定了 用冰融研磨法提取蔗糖酶的最佳条件，即通过反复冰冻 研磨破碎细胞、 !"# 水 浴 加 热 提 取 并 去 除 杂 蛋 白 、 "$% 乙 醇沉淀，在保持较高酶活力和收率的情况下制得成品蔗 糖酶。 蔗糖酶 提取
表+ 乙醇浓度（ 5） 吸光度 < 表) 乙醇浓度（ 5） 沉淀重量（ L） 乙醇提取后上清液酶活
在 水 浴 中 迅 速 加 热 到 +", 后 ， 缓 慢 搅 拌 &"#’( ， 取出 置于冰浴中迅速冷却。然后在冷冻离心机中， "*+, ， 取上清液测酶活。在 +) 、 !)"""- . #’( 离心 !)#’( ， )" 、 以待比较。 )) 、 4", 四个水浴温度下重复以上步骤，
参考文献
!
阎伯旭、 高培基 3 内切葡聚糖苷水解酶的分离纯化和内源荧 王建枝， 何 善 述 : 等 3 绒 毛 !— !， + 葡 萄 糖 苷 酶 的 研 究3生 物 袁静明， 张崇华， 等 3 戊二醛交联根霉葡萄糖淀粉酶的研究 3 余瑞远， 倪逸生， 等 3 大鼠、 小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力
光性质 3 生物化学杂志， ： !886 ， !& （ )） )9"*)9)
!!"
。 %<#< 年 =/>23 等首先指出酵母菌发酵 （ 89:41;234 ） 蔗糖时必须有这种酶的存在。蔗糖在蔗糖酶的作 用 下， 水解为葡萄糖和果糖， 还原力增加， 又由于生成 果糖， 甜度增加 ?%@+A。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为 从 果 糖 末 端 切开蔗糖的 !*=*呋喃果糖苷酶B!*=*C1/;DC/129D3EF23435 回 归 系 数 为 $&...$<- ， 直 线 方 程 为 ： PQ
&" T
+" "3"%9"
)" "3"%8+
4" "3"+4)
6" "3")9+
注： 乙醇浓度在 &"5时几乎没有沉淀。 实 验结 果 显 示 ， 乙 醇 浓 度 从 &"5 增 加 到 )"5 的过程中， 上清液的活性下降较快， 但此阶段沉淀 量增加很大； 乙 醇 浓 度 在 )"5 以 上 时 沉 淀 量 较 多 ， 而酶的活性保持稳定，可认为这时大量杂蛋白已 沉 淀 下 来 。 因 此 在 乙 醇 提 取 中 选 取 )"5 的 浓 度 最 恰当。
67 +&#&%&#,G 和从葡萄糖末端切开蔗糖的 "*=*葡萄糖
苷酶（ 。前者存在于酵母 "*=*HI/0D3EF23435 67 +&#&%&#$） 中， 后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取 。
?-A
人造蜂蜜， 防止高浓度糖浆中的蔗糖析出， 还用来制 造含果糖和巧克力的软心糖等。 本实验目的在于用冰融法在不同的 条 件 下 提 取 酵母中的蔗糖酶， 比较其酶活力， 以确定最佳的提取 条件 ?(5,A。
中图分类号： !"#$%&#’( 文献标识码： ) 文 章 编 号 ： %$$#*$+$, （ #$$# ） $-*$$(-*$#
!O7*%,O 型冷冻离心机。 # 型电热磁力搅拌器，
%#!
蔗糖酶酶活的测定方法
采用 =J" 显色方法， 通过测定样品中还原糖的
量， 确定蔗糖酶酶活 ?LA。
%&#&%
葡萄糖浓度标准曲线
!"#$%"$ &%’ ($")%*+*,- *. /**’ #%’0123-
工艺技术
!!"
!!"
!!"
!!"
!百度文库"
!!"
!!"
!!"
!!"
!!" !!" !!" !!" !!" !!" !!" !!" !!" !!"
蔗 糖 酶 提 取 方 法 的 研 究
!!" !!" !!"
（ 河北科技大学生物工程学院， 石家庄 $"$$&’）
!"#$%&’$ !"#$ %&%’( #)*(+,-.’$ *"’ /’*"+, +0 #)1’(*&$’ ’2*(&.*#+) +0 0(+/ 3’&$*4 5) +(,’( *+ 6’* 0#)#$"’, %(+,-.* +0 #)1’(*&$’ 7#*" "#6" &.*#1#*3 &), 3#’8,9 *"’ 0+88+7#)6 %(+.’$$’$ &(’ ’/%8+3’, #) *"’ ’2%’(#/’)* 7"#." #)1+81’$ :(’&;#)6 .’88$ :3 (’%’&*’, 0(+$* 6(#),#)69 ’2*(&.*#+) #) <=> 7&*’( &), %(’.#%#*&*&*#+) 7#*" =?@4 ()* +,%-# 3’&$*A #)1’(*&$’A ’2*(&.*#+)
取葡萄糖标准品， 用
蒸馏水配置成一定梯度浓度的溶液，与 =J" 显色后 在 (-$9> 测定吸光值。以吸光度 ) 对葡萄糖浓度作 标准曲线， 如图 % 所示。
蔗糖酶 （ "/01234567 +&#&%&#, ） 又 称 转 化 酶
$&,L-,,LR’$&$#L+,( 。 %&#&#
蔗糖酶酶活力计算公式 吸光度 )S%$$$S 稀释倍数 活力单位（ —— —— —— —— —QL-&%%S 吸光度 )S 稀释倍数 T U >I） Q——
! % & +
表& 热提温度（ ,） 沉淀重量（ L）
T T +) )" )) 4"
T "36)4 "36"8 "3)%& "3)"9 "3&!)
不同温度除杂蛋白后沉淀重量
+) "3&"8+
)" "3+"!+
)) "3+98!
4" "38"4"
!3&3%
加热除杂蛋白
将粗提液倒入小锥形瓶中，
!#&
醇提
) ;<=0>? @: 4
A>B>C ;:
D<=E< A3
=(FG-H$I/-F/-J FGKF’(L /M
#GF7/NK M/- HKKHJ /M OJ$H(HKG HPF’Q’FJ3 R ;’/FGP7:!88%:%&S%)6*%6"
朱静， 严 自 正3微 生 物 产 生 的 木 聚 糖 酶 的 功 能 和 应 用 ， 生物 工程学报， ： !884 ， !% （ +） &6)*&69 科学出版社， 6 苏拔贤3生物化学制备技术3北京： !894， !3&"*&4
!!"
!!"
啤酒酵母泥
水乙醇， 冰醋酸， 氢氧化钠， 去离子水， 稀盐酸， 蔗糖， ， 甲苯。 葡萄糖， +， (*二硝基水杨酸（ =J" ）
KK#$$ 型电子天平
!!"
!!"
由石家庄市三九啤酒厂提供， 无
L## 型分光光度计，光学显
!!"
!!"
徐亲民
!!"
关键词 酵母菌
微镜， <%< 型酸度计， "MN*"N 型恒温振荡水浴锅， <%*
!""!#$
’’
蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖， 增加甜味 ， 制造
V 标准曲线 S#S%$
从此公式可知， 蔗糖酶活力与吸光度 ) 成正比。
%#&
%&+&%
蔗糖酶提取方法
细胞破碎 按以下三种方法分别制备三个
样品： 样品一： 分别称取 预 先 在 冰 箱 中 冷 却 的 #$H 酵 母 和 %$H 细 沙 ， 置于预先冷却的研钵中， 捣碎， 加入 研磨约 %$>E9 使其呈均匀的糊状。 分次加 %$>I 甲苯， 每次 ->I ， 每 (>E9 加一次， 再继续 入 +#>I 脱离子水， 研磨 #W ， 镜检破碎情况。
!""!#$
工艺技术
! "#$ %&’ ( "$ )’ %**%
表% 样品管 空白 对比 不同温度除杂蛋白后上清液活性测定 热提温度（ ,） 吸光度 <
样品二： 把 甲 苯 改 为 !"#$ 脱 离 子 水 ， 再按与上 面的方法相同的步骤实验， 并且研磨相同的时间。 它的研磨方法 样品三： 只 加 入 %"#$ 脱 离 子 水 ， 就 在 冰 箱 中 冰 冻 约 !"#’( （ 研磨液 是 每 研 磨 &"#’( ， 面上刚出现冻结为宜） ， 重复以上两个步骤， 直到达 到相同的时间， 并加入 %%#$ 脱离子水。 取沉淀研磨液上清液倒入小烧杯中， 洗 涤 沉 淀 两次， 把洗涤上清液倒入小烧杯中， 分别把三个上清 用冷冻离心机 在 液定容至相同体积， 取 )#$ 上清液， 温度 "*+, ， 转速 !%"""- . #’( 条件下离心 !)#’( 。吸 取上清液， 用 !#/$ . 0 醋酸分别调 12 至 )3" 。
% & +
!#!
加热去除杂蛋白
如表 % 、 表 & 所示， 随温度升高， 上清液中酶活逐
： 化学杂志， !88" ， 4（ %） !"%*!"4 生物化学与生物物理学报， ： !88" ， %% （ &） %98*%8% 学性质 3 生物化学杂志， ： !88& ， 8（ 4） 4)8*44&
渐下降， 包含酶和杂蛋白的沉淀量也增加。从收率方 面来考虑， 上清液的活力越高， 收率越高， 因此要求 温度尽可能低一些。而在一定条件下， 沉淀越多， 酶 液越纯， 从这方面考虑温度高一些好。再依据表 % 中 温度对酶失活变性的影响，蔗糖酶在 )", 时要明显 比 +), 时 失 活 严 重 ； 表 & 说明， 在 )", 时 ， 蔗糖酶大 量沉淀， 使酶液活性降低。 所以选取 +), 作为热提温 度较为适宜。