硝化细菌的分离与鉴定
实验硝化细菌实验报告
一、实验目的1. 了解硝化细菌的基本特性及其在水质净化中的作用。
2. 掌握硝化细菌的培养方法及观察指标。
3. 探讨硝化细菌在不同环境条件下的生长情况。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：硝化细菌菌种、纯净水、氨水、亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、葡萄糖、琼脂、pH试纸等。
2. 实验仪器：恒温培养箱、培养皿、移液枪、烧杯、试管、显微镜、pH计等。
三、实验方法1. 硝化细菌的分离与纯化（1）取一定量的土壤样品，加入无菌水，搅拌均匀。
（2）取适量土壤悬液，接种于琼脂平板上，加入氨水作为氮源。
（3）将平板放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况。
（4）挑取单菌落，接种于新的琼脂平板上，重复步骤（3），直至获得纯化硝化细菌。
2. 硝化细菌的生长曲线测定（1）将纯化后的硝化细菌接种于装有适量纯净水的小试管中。
（2）分别加入不同浓度的氨水作为氮源，设置对照组（不加氨水）。
（3）将试管放入恒温培养箱中培养，定期取样，测定硝化细菌的OD值。
（4）以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制硝化细菌的生长曲线。
3. 硝化细菌在不同环境条件下的生长情况观察（1）将纯化后的硝化细菌接种于装有适量纯净水的小试管中。
（2）分别加入不同浓度的亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠等物质，模拟不同环境条件。
（3）将试管放入恒温培养箱中培养，定期取样，观察硝化细菌的生长情况。
四、实验结果与分析1. 硝化细菌的分离与纯化实验过程中，成功分离出纯化硝化细菌，菌落呈白色，表面光滑。
2. 硝化细菌的生长曲线测定实验结果显示，硝化细菌在氨水浓度为0.5mg/L时生长速度最快，OD值达到最大值。
生长曲线呈典型的S型，表明硝化细菌在适宜的条件下具有较好的生长性能。
3. 硝化细菌在不同环境条件下的生长情况观察实验结果表明，硝化细菌在亚硝酸钠浓度为0.1mg/L、硝酸钾浓度为0.5mg/L、氯化钠浓度为0.5mg/L时生长情况较好，生长速度较快。
在较高浓度的亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠等物质下，硝化细菌生长受到抑制。
三株嗜盐异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮特性的开题报告
三株嗜盐异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮特性的开题报告一、选题背景近年来，氮污染愈加严重，严重影响着水体、土壤以及生态环境的健康。
硝化反应是自然界中氮的循环过程的重要环节，在氨氧化和硝化反应中，氨氧化和硝化细菌是非常重要的催化剂。
其中，硝化细菌催化硝化反应，将氨氮转化为硝酸盐氮，从而使氮得以进一步地循环。
如何发挥硝化细菌在氮循环过程中的作用，成为了污水处理及水资源管理的研究热点。
硝化细菌的耐受性对于生物处理的效果和经济效益有着巨大的影响。
嗜盐异养硝化细菌作为一种具有高盐容忍度的硝化细菌，其独特的脱氮特性在海水养殖废水、沼气污水处理等领域有着广泛的应用前景。
因此，分离鉴定嗜盐异养硝化细菌及其脱氮特性的研究，对于提高生物处理效率、降低处理成本和保护环境等方面具有重要的意义。
二、研究内容本研究将从自然界中采集含有高盐浓度的水样或废水样品，通过离心、传统菌落计数法和分子生物学技术，筛选出嗜盐异养硝化细菌。
通过宏量酶联免疫吸附法和ISH技术等方法，进行接种量的优化；通过生物反应器进行硝化反应实验，研究其脱氮特性以及对于盐浓度的适应性。
同时还将分析影响嗜盐异养硝化细菌的生长和脱氮特性的因素，如氨氮浓度、pH值、温度和盐浓度等物理化学因素。
三、结论预期研究结果将有助于：(1) 掌握嗜盐异养硝化细菌的筛选、分离、鉴定及其适应性特点；(2) 探究嗜盐异养硝化细菌对于水体中氮的转化和脱氮方面的特性，从而为海水养殖废水、沼气污水等领域开发新型的环保脱氮技术提供一定的理论支持和实践经验。
(3) 针对硝化细菌抗盐变异规律的研究，有助于筛选和研发抗盐性更强的氨氧化、硝化细菌菌种。
硝化菌的分离鉴定及多菌复配处理医药化工废水
硝化菌的分离鉴定及多菌复配处理医药化工废水摘要：氨氮是水环境污染重要元素之一，高浓度氨氮不但会导致水体富营养化，而且对水生动植物和微生物也有毒害作用。
而医药化工废水具有高色度、高盐度、成分复杂、高氨氮、难生化降解、生物毒性大等特点，比其他工业污水更难处理，目前去除医药化工废水中氨氮主要有物理法、化学法、生物法，生物法因其具有经济高效、安全无污染等优点，而逐渐成为了研究和应用热点。
但依靠单一微生物处理废水氨氮难以有效去除，筛出不动杆菌属在48h氨氮去除率仅为41.33%。
而生物脱氮中复合菌株之间能通过功效互补、共同作用高效地完成氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的降解。
关键词：硝化菌的分离鉴定;多菌复配处理;医药化工废水引言随着《水污染防治行动计划》的出台，污水排放标准提高，对氮排放总量要求明确，严格控制在15毫克/升(标准1)和20毫克/升(标准2)以下。
按照传统的生物发光法，高氯酸盐工艺由氨、硝基胺和抗心律失常三种工艺组成。
氨是一种通过良好的氧或微生物氧化将一氧化氮分解成铵化废水的过程。
氮转化过程中，硝酸铵转化为硝化甘油，废水中硝化甘油(良好营养)转化为NO2-N和NO3-N。
硝酸盐制取过程中，废水中的NO2-N和NO3-N被取代为抗氧化盐悲观主义(同时也取代了决定惩罚的细菌)。
废水处理中无机氮的沉积主要是通过硝化和硝化进行的。
1医药化工废水的基本特征1.1COD和BOD5含量高化学废水中COD浓度远低于COD5浓度，但在医药和化学废水中COD浓度和COD5含量相对较高。
制药、化学、工业废水未经处理排入水体，会消耗正常水域的大量氧气，导致水体缺氧。
一旦水中氧气含量不足，动植物和其中的微生物将难以生存，这对正常水域也有很大影响。
第二，医药化工废水中存在大量物质，相当复杂，水体的异性也比较大，高浓度有机物也可以在水中大量存在，容易造成水体中各种养分比例的逐渐失衡。
1.2无机盐浓度高经过化学反应，酸碱溶液大量用于医药化工生产大量无机盐溶液。
硝化细菌的分离纯化
材料与方法样品检测用试剂1、Griess 试剂溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。
溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。
格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上，依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有亚硝酸细菌存在。
2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在）称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。
由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。
采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。
然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。
培养基1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）酵母粉 5g 蛋白胨 10gNaCl 10g 蒸馏水 1000ml灭菌前pH=7.32、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml灭菌前pH=7.33、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯）马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g水 1000mL灭菌前pH自然硝化细菌培养基富集培养取样品0.5g于有50ml灭菌培养基的250ml三角瓶在恒温30℃，摇床转速为150r／min，条件下富集培养。
每周一次，用Griess试剂(或二苯胺-硫酸试剂)定性检测HN02(或HN03)的生成情况，判断富集情况的好坏。
硝化细菌分离与鉴定
硝化细菌分离与鉴定硝化细菌-一类专性化能自养（无机营养）细菌，包括亚硝化菌和硝化细菌两个菌群，一般种类不能生长在有机培养基中。
在有氧的条件下，亚硝化细菌群将氨氮转化亚硝酸氮，硝化细菌群将亚硝酸氮转化硝酸氮，两者常生长在一起。
硝化细菌分离比较困难，由于它生长缓慢，平均代时10-20h以上，且不同菌株间差异较大。
1.硝化细菌分离：1.1分离材料：氨场周围的土壤池塘或污水出水口污泥1.2培养基：1.2.1富集培养基：亚硝化细菌培养基：1）硫酸铵5g/l 磷酸二氢钾0.7g/l 硫酸镁0.5g/l 氯化钙0.5g/l 用5％碳酸钠调PH8.0 （硝化细菌用亚硝酸钾2 g/l代替硫酸铵5g/l）2）硫酸铵2g/l 氯化钠0.3g/l 硫酸亚铁0.03g/l磷酸氢二钾1.0g/l 硫酸镁0.03g/l 碳酸氢钠1.6g/l PH7.5-8.01.2.2分离培养基：亚硝化细菌培养基：甲液：硫酸铵11.0g 硫酸镁1.4g硫酸亚铁0.3g蒸馏水100ml乙液：磷酸二氢钾1.36g 蒸馏水100ml甲：乙=9:1 PH8.0-8.2硝化细菌培养基：硫酸铵2.0g磷酸氢二钾1.0g/l硫酸镁0.5g/l氯化钠2.0g/l硫酸亚铁0.4g/l碳酸钙5.0g/lPH7.5-8.0用亚硝酸钾2.5 g代替硫酸铵11.0g。
为增加硝化细菌的分离效果，在培养液中添加1％粉状碳酸钙和0.04ml/100ml微量元素溶液。
1.2.3BPY(肉膏蛋白胨酵母膏培养基)牛肉膏5g/l 酵母膏5g/l 蛋白胨10g/l 氯化钠5g/l 葡萄糖5g/l PH7.0（检查硝化细菌纯度用）1.3富集培养：取泥样1.0g或1.0ml活性污泥接入30ml/250ml三角瓶或10ml/18x180mm试管中，28-30℃130r/min震荡培养，每隔几天用格利斯试剂在白瓷板上检验亚硝酸根的生成，培养7-8d后培养液遇格利斯试剂呈红色，表明有亚硝酸盐存在。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
一株异养硝化细菌的分离鉴定和脱氮特性研究
１ ４ ８ ９ ９ 。筛选 出的菌株 Ｐ ａ ｒ ａ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｄ ｅ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｎ ｓ Ｆ Ｊ Ａ Ｔ 一 １ ４ ８ ９ ９对氨氮具有高效 的去除率 ， 显示 了 良好的应用 前景。 关键词 ： 异养硝化细菌 ； 分离 ； 脱氮副球菌 ； 脱氮能力
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： １ ’ ｈ ｅ ｐ ｒ ｅ ｓ ｅ ｎ ｔ ｐ ａ ｐ ｅ ｒ ｄ ｅ ｌｔ ａ ｗ ｉ ｔ ｈ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｄ ｅ ｎ ｉ ｔ ｒ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ａ ｈ ｅ ｔ ｅ ｒ ｏ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｉ ｃ ｎ ｉ ｔ ｉ ｒ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ｕ ｍ， ｗ ｈ ｉ ｃ ｈ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ
（ １ ． 福建农林 大学 ， 福州 ３ ５ ０ ０ ０ ２ ； ２ ． 福建省农业科学院农业生物资源研究所 ， 福州 ３ ５ ０ ０ ０ ３ ）
摘
要： 筛选对高浓度 Ｎ Ｈ， 一 Ｎ养殖废水具有高效硝化能力的菌株 ， 研究其硝化性能 。通过 比较几种 已报 道的ห้องสมุดไป่ตู้选方法和不 同生境
中异养硝化细菌筛选效果 ， 确定 了以乙酰胺为唯一碳源和氮源 ， 从高 氨氮生境 中可 以筛选到高效 的异养 硝化细菌 ； 进一步通过富集 培养分离 ， 从 沼气池 出水 口水 中分离到一株异养硝化细菌 ， 并根据部分长度 的 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序列进行 了系统发育分析 。该 菌株具有高
高效硝化细菌的分离与鉴定
有生长; 肉汤培养基中 N- 7、S- 3、S- 9 有生长; 硝化细菌 分离培养基中都可以生长, 筛选得到生长快、菌落大的 12 株菌来进行下一步的实验。 21 3 在不同 NO-2 浓度下菌落生长情况
高的同源性, 但是它的电子供体是对苯二酚, 不能氧化
细胞色素 C, 因此 命名该酶为 qN or, 由 qN or 基因编
码[ 7] 。2001 年, G esche 等[ 8] 利 用 N or 对 来自纯培养
和环境样品的系统关系进行了研究。
采用脱氧胆酸钠处理, 再用葡萄糖离心分离, 将得
到的酶液进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
取 N- 1、N- 2、N- 5、S- 2 4 株菌通过 30 mL / 300 mL 摇瓶发酵 5 d 后( 每样 2 个平行) , 在 540 nm 下检测
自然。
硝化细菌 分离 培养 基 ( g ) : N aN O 2 1, M gSO4 #
7H 2 O 01 03, M nSO 4 # 4H 2 O 01 01, K 2 H PO 4 # 3H 2 O 01 75, N aH 2 PO 4 # 2H 2 O 01 25, 葡萄糖 1, 加去离子水
至 1000 m L, pH 值自然。 人工模拟 富集 培养 液 ( g ) : N aN O 2 1, M gSO4 #
条件, 同 时加入少 量的次氯 酸钠抑制 其它杂菌 的生 长[ 4] , 以达到富集硝化细菌的目的。
对富集培养装置中总体积为 2 L 的培养液, 每隔
几天用格利斯试剂检验
N
O
2
的变化情 况, 或用国标
硝化细菌的分离和鉴定
硝化细菌的分离和鉴定
黄珏
【期刊名称】《水产科技情报》
【年(卷),期】2004(31)3
【摘要】水体中的氨氮和亚硝酸盐是水产养殖过程中的产物，对生物体有毒，亚硝酸盐还是强烈的致癌物质。
如何降解这两种物质，是水产科技工作者一直所关注的研究课题。
硝化细菌是一类具有硝化作用的自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是生长速率低，具有好氧性、依附性和产酸性等，可通过NH4+·NO2-·NO3-
【总页数】5页(P130-134)
【作者】黄珏
【作者单位】江苏省兽药监察所,南京市,210036
【正文语种】中文
【中图分类】S963.211
【相关文献】
1.几株异养硝化细菌与好氧反硝化细菌的分离与鉴定 [J], 刘万鑫;杜荣斌;由翠荣;付学军;梁丽琨
2.华北平原农田厚包气带及含水层反硝化细菌的分离鉴定及作用机制研究 [J], 赵会成;刘梦帅;陈帅民;王新珍;王仕琴;胡春胜;刘彬彬;王凤花
3.一株厌氧反硝化细菌的分离鉴定与砷耐受功能研究 [J], 冯纪龙;陈晓明;刘紫薇;罗锋
4.好氧反硝化细菌的分离鉴定及其应用研究 [J], 谢晓娜;张正波;欧阳秋飞;杨郑州;方春秋
5.一株兼性厌氧反硝化细菌的分离与鉴定 [J], 余安祺;张博
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
异养硝化细菌的分离鉴定及组合菌群硝化性能分析
异养硝化细菌的分离鉴定及组合菌群硝化性能分析
蒙海林 刘复荣 何敬愉 张文艳 张宏刚 崔金明
（广州中国科学院先进技术研究所，广东广州５１１４５８）
摘 要： 从养殖池塘中分离筛选具有高效降解氨氮和亚硝酸盐氮能力的异养硝化菌，并
进池一塘步淤研泥究、水其样组和合鱼菌体群肠的道硝样化品性中能进． 分行别菌以株Ｎ分Ｈ离４Ｃ筛ｌ 和选，Ｎ通ａＮ过Ｏ２１为６Ｓ唯ｒ一ＤＮ氮Ａ源测，序从进高行密菌度株养殖鉴
（ ） ２０１７Ａ０３０３１３１４９
作者简介： 蒙海林（１９８０），男，博士，主要从事微生物合成生物学研究． Ｅｍａｉｌ：ｈｌ． ｍｅｎｇ＠ ｇｉａｔ． ａｃ． ｃｎ
通信作者： 崔金明（１９８０），男，博士，主要从事微生物合成生物学研究． Ｅｍａｉｌ：ｊｍ． ｃｕｉ＠ ｇｉａｔ． ａｃ． ｃｎ
收稿日期： ２０１８０６２８
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（３１６７００５６，３１８７０７７６）；广东省科技计划项目（２０１９Ｂ０３０３１６０１６）；广东省自然科学基
金资助项目（ ）；广州市科技计划项目（ ， ） ２０１７Ａ０３０３１３１４９
２０１８０３０２００３５ ２０１９０４０１０３３７
３ 株降解氨氮和亚硝态氮效果较好的菌株，分别为巨大芽孢杆菌Ｗ３１、枯草芽孢杆菌
ＹＺＮ２ 和植物乳杆菌ＨＴ１ ，１ ７２ ｈ 氨氮降解率分别为７１． ２％ 、６１． ３％ 和６０． ７％ ，亚硝态氮
降解率分别为３８． ７％ 、３５． ６％ 和３７． ６％ ． 经过对组合菌群培养优化后，得出以下结果：以
产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ． ）［９］不动杆菌属（Ａｃｉｎｅ 氮的异养硝化菌株．
ｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ）［１０］等． 随着研究的不断深入，人们发现 １． ３ 菌种鉴定
硝化细菌的分离与鉴定
硝化细菌的分离与鉴定硝化细菌的分离与鉴定要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。
硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。
实验结果表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。
实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。
关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。
氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。
可通过NH4+→ NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。
能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。
硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。
研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。
因此筛选出生长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。
本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产率和硝化细菌的利用率。
通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。
国外在硝化细菌的培养方面的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须不断向反应器中补充流失的硝化细菌。
硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将氨直接转化为硝酸盐的细菌。
氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。
高效硝化细菌的分离与鉴定
高效硝化细菌的分离与鉴定硝化作用和硝化细菌简介硝化是自然界中氮循环过程中的一个重要环节。
在这个过程中，氨被氧气氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，称为氧化硝化作用。
硝化作用是氮循环中不可或缺的过程，它可以有效地将氨转化成需要的亚硝酸盐和硝酸盐，供植物进行氮素营养的吸收利用。
硝化细菌是参与这个过程的重要微生物，它们能够利用氨氮，进行硝化作用，将氨氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。
硝化细菌的分类和分布硝化细菌是一类具有氮素自营能力的原核生物，根据研究内容的需要和研究对象的不同，硝化细菌可分为铵化细菌和硝化细菌。
铵化细菌主要能够利用几种有机氮化合物，而硝化细菌则利用氨来进行硝化作用。
硝化细菌广泛存在于土壤、水体和废水处理系统等多种环境中，是自然界中一类十分重要的微生物。
硝化细菌的分离方法硝化细菌的分离方法一般可以分为三个步骤：富集、筛选和纯化。
富集硝化细菌在自然环境中常常处于低密度状态，因此富集方式的选择对分离效果具有重要意义。
最常用的硝化细菌富集培养基是K_2HPO_4-[(NH_4)_2SO_4], NaHCO_3, CaCO_3, MgSO_4.7H_2O和人工海盐等基础培养基。
富集过程中应注意环境氧气需充足，避免长时间培养，以保持细胞处于较低阶段生长状态。
筛选富集后的培养物需要进行筛选，以去除与硝化作用无关的细菌，为硝化细菌留下更大的空间和机会。
筛选方法主要有传统的分离纯化法和现代的DNA分子克隆技术，其中后者具有高效率、选择性强等优点。
纯化纯化过程主要是将被筛选出的细菌紫外线照射处理，在无菌环境下进行更加严格的筛选，并使用转染、PCR和DNA序列鉴定等技术手段，通过对分离出的细菌进行分子鉴定，根据细菌形态特征和分子生态学信息等分析结果，最终确保分离出的细菌纯净度和鉴定准确性。
硝化细菌鉴定方法鉴定硝化细菌的方法主要包括基于形态学和生理学特征的传统鉴定和分子生物学鉴定两类方法。
其中传统鉴定方法可以分为形态学、生理学和生化学三个部分，通过这些基本特征和行为特征，初步鉴定出硝化细菌种名，并进一步进行深入的研究。
一株硝化细菌的分离鉴定及应用
一株硝化细菌的分离鉴定及应用
一、硝化细菌的分离鉴定
1、对硝化细菌的采集：采集硝化细菌的样本是分离鉴定的前提，能够
直接代表被研究的硝化细菌，硝化细菌样本可以直接从自然界中采集，也可以从培养基中采集。
2、硝化细菌样品的处理：采集到的硝化细菌样本要经过处理，以便符
合实验要求。
通常，需要先将样品稀释到10-5或10-6，然后将其置于
相应的细菌培养基中培养，以获得足够的菌落数量。
3、硝化细菌的鉴定：细菌分离出来了，就要进行鉴定，可以通过考察
菌落形态、培养基的选择性反应、生理特性、DNA比对的鉴定等方法
进行鉴定。
二、硝化细菌的应用
1、自由氧化去除鱼肝石油：经过微生物方法处理，可以有效的减少石
油中的自由氧化产物，硝化细菌可以作用在石油上，去除自由氧化物质，从而达到减少污染的效果。
2、促进污泥脱水脱色：硝化细菌具有腐蚀性，能够有效的分解混凝土
中的残留物，促进污泥的脱水，减少有机物的含量，从而达到脱色的
目的。
3、污泥处理去除固形废物：污泥中的固形废物是一个严重的污染源，
硝化细菌能够把污泥中的有机物转化成无机物，减少污泥中固形废物
的含量，从而达到处理去除固形废物的效果。
4、生物制氨：硝化细菌能够把氨基酸和氯气转化成氨，从而实现生物化学制氨。
此外，硝化细菌还可以用于低碳烃氧化、硫酸盐还原、氰化物氧化、烯醇及咪唑衍生物的氧化等。
垃圾中硝化细菌的分离及筛选课题研究报告
垃圾中硝化细菌的分离及筛选课题研究报告硝化细菌系指利用氨或亚硝酸盐作为主要生存能源，以及能利用二氧化碳作为主要碳源的一类细菌。
硝化细菌是古老的细菌之一，其广泛分布于土壤、淡水、海水及污水处理系统中，却在自然界鲜少大量出现，原因在于硝化细菌的分布会受到许多环境因素的影响，如氮源、温度、氧气浓度、渗透压、酸碱度和盐度等等。
本课题研究所用硝化细菌是从垃圾中提取的。
硝化细菌分为亚硝化菌与硝化菌，亚硝酸细菌主要有 5个属：亚硝化毛杆菌属(Nitrosomonas) ；亚硝化囊杆菌属(Nitrosocystis)；亚硝化球菌属(Nitrosococcus)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化肢杆菌属(Nitrosogloea)。
其中，尤以亚硝化毛杆菌属的作用居主导地位，常见的有欧洲亚硝化毛杆菌 (Nitrosomonas europaea)等[19]。
硝酸细菌主要有3个属：硝酸细菌属(Nitrobacter)；硝酸刺菌属 (Nitrospina)和硝酸球菌属(Nitrococcus)。
其中以硝酸细菌属为主，常见的有维氏硝酸细菌(Nitrobacter winogradskyi)和活跃硝酸细菌 (N. agilis)等[19]。
亚硝化菌的主要功能是将氨氮转化为亚硝酸盐；硝化菌的主要功能是将亚硝酸盐转化为硝酸盐。
由于亚硝化菌和硝化菌具有这些功能，使得硝化细菌在环境保护和水产养殖等领域具有重要作用，并已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要性开始引起广泛的注意。
可以说，迄今为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细菌参与其中的净水作用，想获得成功的养殖，是相当困难的。
尤其是现代集约化养殖长期累积了大量养殖生物排泄物，所有有机物的排泄物，甚至其尸体，在异养性细菌的作用下，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量氨等含氮有害物质。
氨在亚硝化菌或光合细菌作用下转化成亚硝酸，亚硝酸与一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝胺。
海洋反硝化细菌的分离鉴定及反硝化性能研究的开题报告
海洋反硝化细菌的分离鉴定及反硝化性能研究的开题报告一、选题背景氮是生物体内的必需元素，但是过高的氮浓度会对海洋生态系统造成严重的影响。
氮化物的直接释放、化学肥料污染和生物体死亡等都会导致海洋中氮的累积浓度过高。
因此，海洋中氮素的循环非常重要。
氮氧化还原反应是氮循环过程的重要环节之一，而海洋反硝化细菌在氮循环中发挥着非常关键的作用。
海洋反硝化细菌能够利用海洋中的硝化物和有机物对硝化物进行反硝化，从而防止海洋氮的过度累积。
然而，目前对于海洋反硝化细菌的研究还非常有限。
因此，对海洋反硝化细菌的分离鉴定及反硝化性能研究具有重要的理论与应用价值。
二、研究内容与目标本研究旨在通过分离鉴定海洋反硝化细菌，并对海洋反硝化细菌的反硝化性能进行研究。
具体内容包括：1. 野外采样选择合适的采样点位，采集海洋水样。
将其带回实验室进行样品处理。
2. 分离鉴定海洋反硝化细菌通过硝酸盐还原试验与特异性Pcr反应，筛选出具有明显反硝化活性的细菌，并进行进一步鉴定, 分离。
3. 反硝化性能评价利用海洋反硝化细菌对海洋中的硝酸盐进行反硝化实验，探究海洋反硝化细菌的反硝化性能。
本研究的目标是：通过分离鉴定海洋反硝化细菌及对其反硝化性能进行评价，为完善海洋氮素循环的机制与生态环境保护提供参考意义的理论支撑。
三、研究思路与方法1. 野外采样选取 1~2 个合适的采样点位，采集海洋水样，样品收集从表层至 5 米深度，记录水样温度、盐度等相关信息，样品名称和采样位置记录到笔记本中。
2. 分离鉴定海洋反硝化细菌将采集到的水样做 10 倍稀释后进行均匀涂布于板上，培养时间大约 1~2 周左右。
取出华丽的菌落进行鉴定，筛选并分离出具有明显反硝化活性的细菌。
通过PCR验证筛选出的菌株是否含有反硝化基因。
3. 反硝化性能评价选定最具代表性的海洋反硝化细菌，进行反硝化实验，并对实验数据进行分析与记录。
四、预期成果1. 成功分离出具有明显反硝化活性的细菌，并鉴定其菌株的特征。
《硝化细菌的分离、培养和观察》活动课教案
《硝化细菌的分离、培养和观察》活动课教案一、活动目的：硝化细菌是生物界中一类特殊的生产者，能进行硝化作用参与氮素的转化，在高中生物学教学中占有一定的地位。
通过实验，既可增加学生对硝化细菌的认识，又能培养学生的操作能力和科研能力，激发学生的学习兴趣。
二、活动安排：学生利用第二课堂分组活动，活动时间为3～4周。
三、活动器材：恒温箱、高压灭菌锅、天平、量杯、玻棒、大试管、三角瓶（250毫升）、显微镜、白瓷板、α—萘胺试剂、二苯胺试剂、醋酸、磺胺酸，革兰氏试剂、PH试纸、(NH4)2SO4、NaH2PO4、K2HPO4、Na2CO3、MnSO4·4H2O、MgSO4·7H2O、NaNO2、NaOH(0.1N)、HCl(0.1N)、浓H2SO4、蒸馏水。
四、活动过程：（一）配制硝化细菌培养液：（二）灭菌将配制好的培养液分装在大试管中，每管约15毫升，堵上包有纱布的棉塞，放在高压灭菌锅中，15磅30分钟灭菌备用。
（三）样品采集：采用公园下层湖水约100毫升即可（强调学生注意安全！）。
（四）接种：用吸管吸取样品，每支试管接1～2毫升样品。
（五）培养：置于28～30℃恒温箱中静置7～10天。
（六）结果测定：1、配制试剂：（1）α—萘胺试剂的配制：用天平称取α—萘胺5克于100毫升醋酸(5N)中，用玻棒搅拌溶解。
（2）二苯胺试剂的配制：用天平称取0.5克二苯胺溶于100毫升浓浓H2SO4中，再加入20毫升蒸馏水中搅拌稀释。
2、NO2-的检验：在瓷盘小孔内各加入1滴α-萘胺试剂，然后加少许试验液，变红色的为(+)，未变色(黄色)的为(-)。
3、NO3-的检验：（1）先除去培养物中的NO2-：方法是在培养物中加入醋酸5～8滴，使之酸化，再加入数粒磺胺酸，当停止放出气体时，再加入一粒磺胺酸，此过程中NO2-转化为N2而逸出。
用α-萘胺试剂检查，如不出现红色，证明培养物中不含NO2-。
（2）检验NO3-的产生：方法是吸取培养物少许于白瓷板凹窝中，滴入二苯胺试剂，如有蓝色出现，即证明有NO3-的积累。
高效硝化细菌的分离与鉴定
０ ７ ， Ｈ２ Ｏ４・２ Ｏ ０ ２ ， 萄 糖 １ 加 １ ０ ． ５ Ｎａ Ｐ Ｈ２ ． ５ 葡 ， ０ ０ ｍＬ 巡 司 河 污 水 ， ｐ 值 至 ７ ０ 调 Ｈ ．。 １ ３ 硝 化 细 菌 的 富 集 ．
ｌ 实 验
１ １ 材 料 与 试 剂 ．
取巡 司河 离水 面 １ ｍ 处 的污泥 １ ， 入 ２ ０ ０ｃ ０ｇ加 ００
０ ０ ，ＮＨ ）Ｓ ． ， ． ３ （ ２ Ｏ ０ ５ 加去离 子水 至 １ ０ ０ ０ｍＬ， Ｈ 值 ｐ
自然 。
硝 化细 菌 分 离 培 养 基 （ ） Ｎａ ， Ｓ ・ ｇ ： ＮＯｚ１ Ｍｇ Ｏ
７Ｈ ２ ０ Ｍ ｎＳ ４ ・ ４Ｈ ２ ０． Ｏ ０． ３， ｏ Ｏ ０１， ２Ｈ ＰＯ ４ ・ ３Ｈ ２ Ｋ ｏ
ｍＬ人 工 模 拟 富 集 培 养 液 中 ， １ ｍ ×１ ｍ ×２ ｍ 在 ０ｃ ０ｃ ０ｃ
富集污 泥来 源０ 北 工 业 大学 门 口巡 司 河 底 。生 湖
物 带 ：４ｃ ２ ｍ× ５ｃ ｍ。
水 槽 中采用 连续 进水 方 式 进 行 硝 化 细 菌 富集 培养 ， 恒
温 培 养 池 的 通 气 量 为 ０ ６ ． ５ｍ。・ｈ 。 实 验 装 置 如 图 １ ＿，
维普资讯
皿
２８ｏ ５ｏ 亿学与生物 Ｚ程 ０，Ｉ ． Ｃ ０Ｖ．Ｎ４ ｈ ２
ｅ ｓ ｒ ＆ Ｂｉｅ ｇｎ ｅ ｉｇ ｍｉｔｙ ｏ ｎ ｉｅ ｒ ｎ
高效 硝 化 细 菌 的分 离 与鉴 定
余 敦 耀 工程 学院 ， １ 湖北 武汉 ４ ０ ６ ；．华 中农 业 大学食 品科 学技 术学 院 ， 北 武汉 ４ ０ ７ ） ３ ０８ ２ 湖 ３ ０ ０
亚硝 酸钠 ， 湖北 大 学 化工 厂 ； 氨 基 苯磺 酸 ， 国 对 中
硝化细菌和反硝化细菌的分离纯化方案(新)
硝化细菌相关培养基：1、富集培养基：硝化细菌富集培养基： KNO2 0.5g; KH2PO4 0.07g;MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.亚硝化细菌富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g; KH2PO4 0.07g;MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.2、分离固体培养基：硝化细菌平板分离固体培养基： KNO2 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．亚硝化细菌平板分离固体培养基：(NH4) 2SO4 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．3杂菌检验培养基：（1）检查异养型细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）：酵母粉：0.5g 胰蛋白胨：1.0g氯化钠：1.0g 琼脂：1g(2)检查酵母菌：豆芽汁葡萄糖培养基： 10%豆芽浸汁100ml 葡萄糖5g 琼脂1.5—2.0g自然PH(3)检查霉菌:马铃薯葡萄糖培养基: 20%马铃薯浸汁100ml 葡萄糖2g 琼脂1.5—2.0g自然PH1、富集培养基：反硝化细菌富集培养基: KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O0.2g, 微量元素蒸馏水1 000mL, 121 ℃ , 灭菌20min.2、反硝化细菌分离培养基： KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, 微量元素MgSO4·7H2O 0.2g, 蒸馏水1 000mL, 琼脂121 ℃ , 灭菌20 min.反硝化细菌为异养型菌，故可以在LB培养基上培养。
活性污泥中高效硝化细菌的分离与初步鉴定
理生 化性 质 和硝化 能力 等方 面 进行 了研 究与初 步 鉴 定， 以期 为 污水生 物脱 氮提 供 理论依 据 和实 际参 考 。
取青 岛市泥布湾生 活污水处理厂 活性污 泥 １ ｍＬ 加入 到盛有 １ ５ ０ ｍ Ｌ硝化 细菌无机盐基础 培养基三角
瓶中， ２ ８ ℃条件 下 摇 床 培 养 。每 隔 几 天 用 格 里 斯 试
有机 培养基 上 生 长 。已有 大 量 的研 究 表 明 ， 理想 的
类 的健康 。 因此 ， 处 理高浓 度含氮 废水 、 控制 水体 富 营 养化 已经成 为世 界性环 境 问题 。
目前 ， 含 氮废水 的主要 处理 方法 有生物 法 、 吹脱
法、 离子 交换 法 、 折点 加 氯 法 等口 Ｊ ， 其 中生 物 法 由于 具 有适用 范 围广 、 投 资少 、 操 作 简单 、 无 二次 污染 、 废
第 ２ ０卷 第 １ 期
自养硝化细菌的分离、鉴定及系统发育分析
自养硝化细菌的分离、鉴定及系统发育分析陈梅娟;蒋进元;周岳溪;胡翔【期刊名称】《环境科学研究》【年(卷),期】2010(023)003【摘要】以城市污水处理厂A~2/O工艺中好氧活性污泥为菌源,筛选出2株自养型硝化细菌N3和N4. 转接2株菌株至液体分离培养基中培养14 d,经检测,2株菌株的硝化效果均可达100%. 通过形态观察、生理生化试验初步鉴定表明,这2株菌株均属于硝化杆菌属. 利用PCR扩增、克隆、测序对菌株作进一步鉴定,测序结果提交GenBank进行同源性检索,并通过MEGA软件进行比对和系统发育分析. 16S rDNA序列分析表明,这2株菌株与维氏硝化细菌的同源性高达98%.【总页数】6页(P340-345)【作者】陈梅娟;蒋进元;周岳溪;胡翔【作者单位】北京化工大学化学工程学院,北京,100029;中国环境科学研究院水污染控制技术研究中心,北京,100012;中国环境科学研究院水污染控制技术研究中心,北京,100012;中国环境科学研究院水污染控制技术研究中心,北京,100012;北京化工大学化学工程学院,北京,100029【正文语种】中文【中图分类】X501【相关文献】1.两株自养型氨氧化细菌的分离、鉴定及系统发育分析 [J], 窦立军;蒋进元;黄永亨;周岳溪;崔俊涛;李越2.一株异养硝化细菌的分离及系统发育分析 [J], 张光亚;陈美慈;韩如旸;闵航3.异养硝化细菌的分离鉴定及组合菌群硝化性能分析 [J], 蒙海林; 刘复荣; 何敬愉; 张文艳; 张宏刚; 崔金明4.育肥猪肠道变形杆菌的分离鉴定及系统发育性分析 [J], 于季申; 孟祥竹; 陈宜贤; 张晓轩; 倪宏波; 李鹏5.中国黄麻炭疽病病原菌的分离鉴定及系统发育分析 [J], 郭艳春;张立武;姚嘉瑜;张镕斌;陈思远;垚何青;陶爱芬;方平平;祁建民;张列梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
硝化细菌的分离与鉴定要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。
硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。
实验结果表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。
实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。
关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。
氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。
可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。
能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。
硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。
研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。
因此筛选出生长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。
本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产率和硝化细菌的利用率。
通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。
国外在硝化细菌的培养方面的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须不断向反应器中补充流失的硝化细菌。
硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将氨直接转化为硝酸盐的细菌。
氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。
对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。
大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。
当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。
一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。
水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L，低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。
另外，碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。
本文中筛选硝化细菌的依据主要是生长速率和硝化作用强度，生长速率主要采用活菌计数，因为硝化细菌的液体培养基中有沉淀，用OD600测的值误差较大。
氨转化效率和硝化作用强度主要用比色法测定，利用亚硝酸根的显色反应。
亚硝化菌测定其培养液中亚硝酸根的增加量，硝化菌测定其亚硝酸根的减少量。
1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 菌种由海洋中分离得到1.1.2 培养基亚硝化菌培养基(NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO4•7H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO4•7H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基NaNO2 1g MgSO4•7H2O 0.03g MnSO4•4H2O 0.01g K2HPO40.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸馏水1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂肉汤培养基牛肉膏0.5％蛋白胨1％氯化钠0.5％琼脂2％1.1.3 试剂牛肉浸膏上海长阳生化制药厂蛋白胨上海东海制药厂磷酸氢二钾浙江临平化工试剂厂磷酸二氢钠南京化学试剂一厂磷酸氢二钠南京化学试剂一厂氯化钠南京化学试剂一厂MnSO4•4H2O 南京化学试剂一厂琼脂江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂（NH4）2SO4 南京化学试剂一厂FeSO4•7H2O 上海试剂二厂MgSO4•7H2O 上海试剂四厂CaCl2 华东师范大学化工厂Na2CO3 上海虹光化工厂NaNO2 淮安化工二厂磺胺酸天津瑞金特化学品有限公司α-萘胺上海泗联化工厂1.2 实验方法1.2.1 硝化细菌的分离将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。
1.2.2 形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。
（2）镜检观察：单染色法（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。
1.2.3 细菌的培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。
（2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中，于20-28℃培养，其中pH控制在6.0以上。
每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。
1.2.4 硝化作用测定1.2.4.1 试剂（1）格利斯试剂溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30％）中，保存于棕色瓶中。
溶液Ⅱ：称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。
（2）2%醋酸钠溶液将2g无水醋酸钠加入到100ml蒸馏水中，混匀溶解。
1.2.4.2 方法☆标准曲线的绘制①称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中NO2-的浓度为30mg/ml，用时稀释至NO2-为0.03mg/ml。
②吸取NO2-标准液（NO2-0.03 mg/ml）0、1、2、3、4、5 ml，分别放入50 ml容量瓶中，每一容量瓶NO2-浓度为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μg/ml；各加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。
③用分光光度计于520nm处比色，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
☆培养液中NO2-测定①亚硝化菌氨转化作用测定取1 ml培养液于50 ml容量瓶中，加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。
用分光光度计于520nm处比色。
②硝化菌硝化作用强度测定取1 ml培养液稀释100倍（视培养液中NO2-浓度而定），取稀释后的培养液1 ml于50 ml容量瓶中，加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。
用分光光度计于520nm处比色。
☆结果计算＠标准曲线以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
回归得到方程y=ax+b＠亚硝酸根浓度= ，mg/ml d=稀释倍数1.2.5 细菌浓度测定（1）取0.1ml培养液加到0.9ml生理盐水中，混匀，就得到10－1的菌悬液，再取出0.1ml加到0.9ml生理盐水中，得到10－2的菌悬液，同样方法依次稀释到10－3、10－4的菌悬液，具体情况视菌悬液浓度而定。
（2）将稀释好的菌悬液取0.1ml，与冷却到50℃的琼脂培养基混匀，于24℃培养5天，进行计数。
2 结果2.1 亚硝酸盐浓度测定标准曲线用亚硝酸根标准液，加入格利斯试剂，于752分光光度计上520nm处比色，以亚硝酸根浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。
见图1。
图1亚硝酸盐浓度测定的标准曲线Fig 1 The standard curve of nitrite detection 2.2 硝化细菌的鉴定2.2.1 形态结构鉴定—单染色法经单染色法观察，亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大；硝化菌体积较小。
与文献所述相同。
见图2和图3。
图2 亚硝化菌的形态Fig 2 The morphology of sub-nitrobacteria 图3 硝化菌的形态Fig 3 The morphology of nitrobacteria2.2.2 培养特征将挑选出来的菌落接种到肉汤琼脂培养基上，没有生长，可以认为该菌为自养菌。
（硝化细菌是严格的自养菌不能在肉汤培养基上生长）2.2.3 硝化作用鉴定将亚硝化菌和硝化菌接种到液体培养基中，于24℃培养5天，在亚硝化菌的培养液中加入格利斯试剂，溶液变红可以判断为亚硝化菌；将硝化菌的的培养液取出1ml稀释100倍，加入格利斯试剂，于752分光光度计上比色，看其中的亚硝酸根含量减少，可以断定为硝化菌。
2.3 氨转化作用和硝化作用2.3.1 亚硝化菌的氨转化作用亚硝化菌经过5周的摇瓶培养能使培养液中亚硝酸根的浓度能上升到300 μl/ml以上，说明其具有亚硝化作用。
实验结果见图4。
图4 亚硝化菌的氨转化作用Fig 4 The ammonia conversion of sub-nitrobacteria2.3.2 硝化菌的硝化作用硝化菌经过10天左右的发酵培养可使发酵液中的亚硝酸根浓度下降40％左右。
实验结果见图5。
图5 硝化菌的硝化作用Fig 5 The nitrification of nitrobacteria2.4 硝化细菌的培养2.4.1 发酵培养硝化细菌的pH值变化由于硝化细菌产酸，发酵罐中的pH值一直呈下降的趋势，但是由于酸性环境不利于硝化细菌的硝化作用，所以pH值最好控制在6.0以上。
实验结果见图6。
2.4.2 发酵培养硝化细菌溶氧的变化硝化细菌是一种好氧的自养菌，由于硝化细菌生长速度缓慢，发酵液中的菌浓度一直较低，因此溶氧一直较高，最低时也有68％左右。
在发酵后期随着菌体的自溶，溶氧还有上升的趋势，实验结果见图7。
图6 发酵罐培养硝化细菌的pH值变化曲线Fig 6 The pH curve of nitrobacteria cultivation in fermenter 图7 发酵罐培养硝化细菌的DO值变化曲线Fig 7 The DO curve of nitrobacteria cultivation in fermenter2.4.3 发酵培养硝化细菌的生长曲线该生长曲线由发酵液活菌计数得到，横坐标为发酵时间，纵坐标为含菌量的对数值。
由该生长曲线可以看出硝化细菌和一般的异养菌的不同，硝化细菌的生长较缓慢，其对数生长期要5天左右才能到达，菌浓度也很低。